miR-34b促进关节软骨细胞基质退变的分子机制研究

王丹丹 陈刚 叶俏 鲍轶 官俏兵

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变为主要特征的关节疾病，它是导致老年人慢性肌肉骨骼疼痛和活动障碍的最主要原因，但是目前关于OA的发病机制尚未完全清楚。微小RNA（miRNA）是一类小分子非编码RNA，具有保持和调节人体正常生理功能的重要作用。有研究发现miRNA异常表达与OA的发生密切相关[1]，但关于miR-34b在OA中的生理功能和潜在的分子机制尚不明确。故本研究检测miR-34b在OA软骨细胞中的表达，通过转染miR-34b的模拟物或抑制物调节软骨细胞内miR-34b的表达量，探索其对软骨细胞基质代谢和Smad3表达的影响；同时检测miR-34b是否直接靶向Smad3，进而初步解释miR-34b在OA发病机制中的作用，为OA的预防与治疗提供新的切入点。

1 材料和方法

1.1 标本来源 标本来自2014年6月至2015年10月本院骨科收治的住院患者。OA软骨组织标本取自10例行全膝关节置换的OA患者（依据美国风湿病协会OA诊断标准诊断为膝关节终末期OA[2]）的膝关节，排除有糖尿病、骨骼发育障碍性疾病、其他类型关节炎、肿瘤、感染、其他慢性炎症性疾病以及糖皮质激素治疗史者。正常膝关节软骨组织标本取自7例因车祸而截肢患者的膝关节，排除有糖尿病、关节痛、关节功能受限、其他类型关节炎罹患史、恶性肿瘤以及糖皮质激素治疗史者。本实验使用的人软骨组织标本符合医学伦理学原则，标本采集取得所有患者的知情同意。

1.2 仪器及试剂 人软骨肉瘤细胞株SW1353购自中国科学院细胞库；DMEM/F12培养基、FBS、青霉素、链霉素均购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶均购自美国sigma公司；Lipofectamine 2000、Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司；实时定量反转录聚合酶链反应 （RT-qPCR）试剂盒购自日本Toyobo公司；2×Taq PCR Master Mix购自美国Applied Biosystems公司；经过特殊化学修饰的miR-34b模拟物（miR-34b mimic）、miR-34b抑制物（miR-34b inhibitor）、无义序列均购自广州锐博生物公司；PCR仪购自美国Biometra公司；恒温CO2培养箱购自德国Heraeus公司。

1.3 软骨细胞的分离、培养及转染 将收集的OA软骨组织和正常膝关节软骨组织置于无菌培养皿，0.25%的胰蛋白酶37℃消化30min，PBS清洗；剪碎软骨组织至1mm×1mm×1mm大小，加0.2%的Ⅱ型胶原酶，置摇床上37℃消化5h；过滤器过滤，收集滤液，离心收集细胞；将细胞悬浮于含10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM/F12培养基中。SW1353细胞用含有10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM/F12培养基，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，每2d更换1次培养液。转染时SW1353细胞接种在6孔板内，待80%细胞汇合后用Lipofectamine 2000转染，参照说明书进行操作。实验设4组：空白对照组（只加入等量的脂质体，A组）、SW1353细胞转染无义序列组（B组）、SW1353细胞转染miR-34b mimic组（C组）、SW1353细胞转染miR-34b inhibitor组（D组）。

1.4 RT-qPCR 引物设计及合成委托英骏生物技术有限公司进行，各基因的引物序列见表1。以Trizol试剂、氯仿提取软骨细胞的总RNA，异丙醇沉淀回收RNA，75%乙醇洗涤RNA沉淀。取≤1μg的RNA，以各基因引物片段为特异引物，用ReverTra Ace-α-试剂盒合成cDNA。PCR反应条件：94℃ 5min；然后进入94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min的循环（共40次）。以β-actin和 U6分别作为mRNA和miRNA的内参，计算机分析Ct值，采用2-△△Ct法计算相对表达量，即miR-34b表达水平。

表1 RT-qPCR反应引物序列

1.5 荧光素酶报告基因实验 使用Targetscan基因信息软件预测得到Smad3是miR-34b靶基因，构建Smad3 野生型及突变型 3′非编码区（3′-UTR）-荧光素酶报告载体，利用荧光素酶报告基因实验检测miR-34b对Smad3基因野生型及突变型3′-UTR荧光素酶活性的影响。293T细胞使用DMEM/F12培养基，在37℃、5%CO2的培养箱中培养；将荧光素酶报告载体与miR-34b mimic及对照组无义序列共转染293T细胞，36h后收获细胞；使用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.6 统计学处理 应用SPSS 15.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OA软骨组织与正常膝关节软骨组织中miR－34b表达水平比较 OA软骨组织中miR－34b表达水平（2.79±1.94）明显高于正常膝关节软骨组织（0.11±0.17），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 SW1353细胞转染后miR－34b表达水平 SW1353细胞转染后，与A组miR－34b表达水平（0.12±0.19）比较，C 组（3.79±0.11）明显升高，D 组（0.01±0.03）明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；A组与B组（0.11±0.18）比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

2.3 荧光素酶报告基因实验结果 经生物信息学软件预测，Smad3是miR－34b的潜在靶基因。荧光素酶报告基因实验证实，共转染miR－34b mimic与pMiR－ReportTM－Smad3野生型3′－UTR质粒后，荧光强度较转染无义序列、pMiR－ReportTM－Smad3 野生型 3′－UTR质粒均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；共转染 miR－34b mimic与pMiR－ReportTM－Smad3突变型3′－UTR质粒后，荧光强度与转染无义序列、pMiRReportTM－Smad3 突变型 3′－UTR 质粒比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；提示miR－34b可特异性地与Smad3的3′－UTR结合。RT－qPCR法进一步检测转染miR－34b mimic和 miR－34 inhibitor后 Smad3基因mRNA 表达水平，与A 组（0.51±0.12）比较，C组（0.07±0.04）明显降低，D 组（1.12±0.06）明显升高，差异均有统计学意义（均 P＜0.05）；A 组与 B 组（0.52±0.08）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 转染后SW1353细胞中Ⅱ型胶原、MMP－13的mRNA表达水平 转染后，与A组比较，C组Ⅱ型胶原mRNA表达水平明显降低，D组明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；C组MMP－13 mRNA明显升高，D组明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 4组不同条件下细胞的Ⅱ型胶原、MMP-13 mRNA表达水平比较

3 讨论

早期诊断、早期治疗OA具有重要的临床意义。miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，普遍存在于在动物和植物中，在基因表达方面有重要的调控作用。miRNA通过与靶mRNA的3′－UTR结合，进而降解靶mRNA或抑制mRNA转录后翻译，调节蛋白质的生成，从而发挥效应[3－4]。在生物发育的不同阶段，miRNA对细胞的增殖、分化和凋亡等过程均有影响，因此它能对机体发育、体内稳态的保持和骨代谢等过程进行调解[5－6]。miRNA异常表达可能会引起OA，如Iliopoulos等[7]发现人OA软骨细胞内miR－140表达水平明显下降，Miyaki等[8]通过构建miR－140基因缺失小鼠，成功诱导出以蛋白多糖丢失、关节软骨纤维化为特征的OA样改变。因此，确定OA中miRNA发挥作用的分子机制非常重要。本实验结果证实，OA软骨细胞中miR－34b表达水平较正常软骨细胞明显增加。

miRNA需要通过与其靶基因相互作用，从而发挥调节基因表达的功能。因此，首先要寻找miR－34b靶基因。笔者使用Targetscan基因信息软件预测，发现Smad3 mRNA的3′UTR中含有与miR－34b互补结合的序列。进一步作荧光素酶报告基因实验，证实Smad3是miR－34b的直接靶基因，且在SW1353细胞中过表达miR－34b后，Smad3 mRNA表达水平明显下调。以上结果表明Smad3是miR－34b的功能介导者。转化生长因子－β（TGF－β）信号通路在软骨细胞的分化、增殖和成熟以及软骨基质的合成中具有重要的调节作用，TGF－β信号通路异常与OA的发生密切相关[9]。Smad3是连接细胞外TGF－β信号的细胞内分子，在缺乏Smad3的小鼠中可观察到OA症状[10]。另外，过表达的Smad3会提高软骨形成过程中软骨细胞的生长和分化，下调Smad3会减弱这个过程[11]。本实验结果显示，miR－34b可能通过抑制Smad3的活性，从而影响TGF－β信号通路，促进软骨细胞分解代谢，加速软骨基质降解，最后导致OA。

本研究进一步验证miR－34b在OA发病机制中的作用，即转染miR－34b mimic或inhibitor上调或抑制SW1353细胞中miR－34b的表达后，利用RT－qPCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达水平。实验结果显示miR－34b mimic转染后，Ⅱ型胶原mRNA表达下调，而miR－34b inhibitor会上调Ⅱ型胶原mRNA表达。以上结果提示miR－34b可以抑制软骨细胞的合成代谢能力。MMP－13在OA的发病机制中具有重要作用[12]。本研究结果发现，当软骨细胞转染miR－34b mimic时，MMP－13 mRNA表达水平明显升高；转染miR－34b inhibitor时，MMP-13 mRNA表达水平明显下降。前期相关研究报道在人和鼠软骨细胞中，降低Smad3表达水平会导致MMP-13表达水平升高[13]。以上结果表明，miR-34b可能通过靶向抑制Smad3的表达，从而促进软骨细胞基质的分解代谢。

综上所述，miR-34b在OA软骨细胞中表达明显上调；miR-34b可能通过靶向调节Smad3的表达，诱导人关节软骨细胞基质退变，进而促进OA的发展。关节软骨细胞中miR-34b的功能研究可为OA的预防与治疗提供新的切入点，建议多关注其影响软骨基质代谢的分子机制研究，这可能为OA的防治开拓新的领域。

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