论多肽的固相合成法研究进展

闫凤

摘要：在生物工程中，對多肽的研究是重要的一项工作内容。随着社会的发展，合成多肽类生物活性物质对于生物工程技术的发展有着越来越重要的意义。下文介绍了多肽合成的原理方法和现阶段的问题，并对其研究进展作了具体阐述。

关键词：多肽；固相合成法；生物；氨基酸

引言

多肽是一种由氨基酸组成并广泛存在于生物体内的重要化学物质。就目前而言，研究人员已经在生物体内发现数万种多肽物质。在实践中，由于多肽具有良好的安全性和生物活性，所以日益受到生物研发人员的重视。随着我国生物工程的发展和社会经济的进步，多肽固相合成技术已经日臻成熟，其工艺稳定性和安全性都有所提高。

1相合成的基本原理

多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端羧基端）向N端（氨基端）合成。首先将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，经过脱去氨基保护基并同过量的活化的第二个氨基酸反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→进一步缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽物质。

2多肽固相合成法现阶段的问题

现阶段，虽然经过研究人员的不断改进和完善，多肽固相合成法已经能够合成很多具有生物活性的多肽和蛋白质，但其本身还存在着很多问题与缺陷，如直接合成的序列短、所需时间长、合成的效率和纯度低、成本高等，这些问题都限制了多肽固相合成法的应用范围。

2.1合成多肽的序列短

自从BMerrifield发明了多肽固相合成法后，多肽的化学合成成为蛋白质大量重组表达的有效辅助工具，被广泛应用于结构生物学、免疫学、蛋白质工程和生物药物研究中。尽管在肽链合成后的性质、分析等方面都有很大提高，但是当肽链残基大于三十个，尤其超过五十个时，肽链的合成就会受到一定程度的制约。多肽固相合成被局限于小片段多肽的合成。

2.2合成效率及纯度不高

对于富含二硫键和碱性氨基酸残基的多肽固相合成，即使是在30个氨基酸以内，仍比较困难，一部分多肽不能成功合成。随着氨基酸数量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增长，目的肽的纯度相应降低，后续的纯化和重复性愈加困难。合成多肽的树脂和保护氨基酸等原料昂贵，多肽合成的成本高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。

2.3合成时间长

经过几十多年的发展，多肽固相合成的速率取得了很大提高，但是相对其他合成方式（如生物合成法）来说，肽链的合成速率仍然很慢。每结合上一个氨基酸大约需要二十到一百二十分钟，平均一个九肽的合成需要五小时以上。另外，当合成结构较复杂的多肽序列时，链的结合时间更长。

2.4合成试剂的毒性大

DCM、DMF为多肽固相合成的首选试剂，其应用量大、毒性高，对身体及周边环境危害大。这些有机化学试剂成为废液后均需要报环保局进行处理。在合成过程中应用的仪器大多可在全封闭条件下进行，但其排出的废气、废液等，对环境仍有一定的污染，不能保证百分百安全。因此，随着多肽固相合成法的发展与广泛应用，国家对研制开发出新型的、危害小的合成试剂的需求越来越迫切。

3合成方法

3.1Boc合成法

采用三氟乙酸（TFA）可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc保护的α-氨基酸共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化、偶联下一个氨基酸，最终采用强酸HF法或三氟甲磺酸将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc合成法中，由于要反复地用酸来脱保护以便进行下一步的偶联，这就引入了一些副反应，如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定并发生副反应。

3.2Fmoc合成法在Fmoc法

研究人员采用了可被碱脱除的Fmoc作为α-氨基酸的保护基，侧链采用酸脱除的Boc保护方法。Fmoc作为氨基保护基的优点在于它对酸稳定，用TFA等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，侧链用对碱稳的Boc进行保护等。肽段最后用TFA/二氧甲烷定量地从树脂上切除，避免了采用强酸。Fmoc法与Boc法相比，由于Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，而被广泛应用于多肽合成中。

3.3固相合成的聚合物载体的选择

将固相合成与其他多肽合成技术分开来的最主要的特征是固相载体，而能被用作多肽固相载体的聚合物必须满足以下条件：第一，必须包含合适的连接分子或反应基团，使肽链能连接在载体上面，并在以后除去。第二，必须提供足够的连接点，以满足肽链不断增长的需要。第三，必须在合成过程中保持稳定并且不与氨基酸分子反应。目前用于固相合成的聚合物载体主要有三类：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚乙烯—乙二醇类树脂及衍生物。这些聚合物载体只有引入相应的连接分子，才能与氨基酸进行连接。根据连接分子的不同，树脂又被分为以下几种：羧基树脂、氯甲基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。

3.4连接分子

一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定，并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子，同时连接分子还需要根据与树脂相连的肽的C端的结构类型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物来选择。固相多肽合成使用过的连接分子为含有对苯甲酰基、氯甲基、巯甲基、丁邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。

3.5肽键的形成

固相中肽键的形成原理与液相中的基本一致，应用的方法主要有缩合剂法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法由于在肽键的形成过程中可以减少副反应并抑制消旋的发生，最终得到的多肽收率高等优点而应用最广。

3.6多肽的切割与纯化

按既定的顺序合成完多肽后，就要把目标多肽从树脂上切割下来，并进行进一步的纯化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法两种，因此，它们的切割方法也不完全一样。在Boc法中，主要用TFA+HF裂解和脱侧链保护。在Fmoc法中直接用TFA进行切割。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用亲和层析、高效液相色谱、毛细管电泳等方法来实现。

结束语

多肽固相合成法自研究以来，已经在工艺上了很大改进，随着人们对生物化学领域关注度的增高，多肽固相合成法研究工作的重要性日益凸显了出来。研究人员如何进一步优化其纯度，有效去除杂质是研究工作的重点内容。多肽杂质谱具有比较高的复杂性，为此，研究人员需结合多肽的结构特点，加强固相合成工艺研究与控制，建立相应的研究控制策略，尽可能地降低潜在杂质的生成，保证多肽产品的质量。

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