二肽基肽酶-Ⅳ抑制剂对糖耐量减低Wistar大鼠胰岛α细胞的影响*

张文娟，尹 飞，郭淑芹，周 雪，苑晓超，姚明言，李志红

(河北省保定市第一中心医院内分泌二科 071000)

随着现代生活方式的改变和社会老龄化的加剧，2型糖尿病、糖尿病前期发病率逐年增加。糖尿病前期包括空腹血糖调节受损(IFG)、糖耐量减低(IGT)2种情况。根据美国糖尿病协会(ADA)的预测，到2030年，全球糖尿病前期患者将达到4.7亿[1]。国内流行病学调查显示，我国现有糖尿病患者9 240万例[2]，居世界之首；糖尿病前期患者约占总人口的15.5%，约有1.48亿人处于糖尿病前期。2010年成人流行病学统计显示，我国糖尿病前期患病率为51.1%[3-4]。因此，如何对糖尿病前期人群进行科学有效的干预并降低糖尿病的发病率成为亟待解决的问题。研究发现，糖尿病前期已存在不同程度的胰岛α细胞增生，例如注射链脲佐菌素的小鼠在发生糖尿病后可观察到α细胞的增生，而应用二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制剂的小鼠并未出现该状况。目前尚未有研究报道关于DPP-4抑制剂对IGT大鼠胰岛α细胞的作用。本研究通过观察西格列汀对IGT大鼠血糖、血脂代谢的影响，探讨DPP-4抑制剂对IGT大鼠胰岛α细胞的作用,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选取4～5周龄雄性Wistar大鼠42只(购于河北医科大学动物饲养中心)，体质量140～160 g，常规饲料适应性喂养1周后(6只/笼)，按大鼠体质量大小编号，按照随机数字表法将大鼠分为健康对照组(NC组，14只)和IGT组(28只)。同组动物体质量相差小于10%，各组间动物体质量相差小于5%。NC组给予常规饲料，IGT组给予高糖高脂饲料(饲料提供热量21.8 cal/g，其中脂肪占56.0%，蛋白质占7.0%，碳水化合物占37.0%)。2组大鼠每日早晚各投食1次，投食量为体质量的3%，均自由饮水，自由活动。室温控制在18～22 ℃，光照周期12 h。饲养至12周时，行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，具体方法：空腹10～12 h过夜，尾静脉采血测空腹血糖(FBG)后，立即给予50%葡萄糖注射液2 g/kg体质量灌胃，服用2 h后再次鼠尾静脉采血检测血糖。

IGT诊断标准[5]：大鼠OGTT、餐后2 h血糖(2 hBG)为7.8～11.1 mmol/L，则为IGT造模成功。

1.2 方法 成模后按照随机数字表法，将IGT组随机分为IGT对照组和西格列汀组(Si组)，每组各14只大鼠。其中，Si组每日1次西格列汀灌胃[30 mg/(kg·d)]，NC组及IGT对照组均给予等体积生理盐水灌胃，2组继续以高脂高糖饲料喂养4周。

于干预前后在3组大鼠中各取50%，禁食12 h后称重，检测FBG、2 hBG、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)水平。腹腔注射5%水合氯醛麻醉，处死动物，快速提取大鼠胰腺组织。

标本处理：所得胰腺组织以10%甲醛溶液固定，常规切片后行苏木精-伊红染色(HE染色)，光镜下观察胰岛形态学改变；采用免疫组织化学染色法观察胰岛α细胞面积的变化，显色结果采用IPP6.0系统，根据胰岛α细胞胰高血糖素标记阳性面积的百分比进行定量分析。每张标本随机选取5个视野，计算每个视野内染色区域的胰高血糖素阳性面积占所观察胰腺组织面积的比值，取每个标本的平均值进行统计分析。采用免疫荧光单标法测定胰岛α细胞胰高血糖素蛋白的表达情况，显色结果采用IPP6.0系统根据显色面积和强度进行定量分析。分析结果采用吸光度(IOD)值表示，图像分析的IOD=lg(背景平均灰度值/待测目标平均灰度值)。标本的荧光显色颜色越深，分布范围越广，IOD值越大，阳性物质相对水平越大。每张标本随机选取5个高倍视野(×150)，计算每个视野内染色区域的IDO值，取每个标本的平均值进行统计学处理。

2 结 果

2.1 大鼠体质量、血糖和血脂的比较 干预前，与NC组比较，IGT组、Si组的大鼠体质量均增加，2 hPG、TG、TC水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；3组FBG水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；IGT组和Si组的大鼠体质量、FBG、2 hPG、TG及TC水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。西格列汀干预4周后，与同期IGT组及干预前Si组比较，Si组的大鼠体质量、2 hPG、TG及TC水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；FBG水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组比较，上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 大鼠体质量、血糖和血脂的比较

注：与NC组比较，△P<0.05；与IGT组比较，*P<0.05；同组间干预前后比较，#P<0.05

2.2 大鼠胰高血糖素、胰岛α细胞面积和胰高血糖素表达情况比较 干预前，与NC组比较，IGT组、Si组的胰高血糖素水平、胰岛α细胞面积百分比和胰高血糖素表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。西格列汀干预4周后，与同期IGT组及干预前Si组比较，Si组的大鼠胰高血糖素水平降低，胰岛α细胞面积百分比和胰高血糖素表达水平下降，差异均有统计学意义(P>0.05)。与NC组比较，上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1。

表2 大鼠胰高血糖素、胰岛α细胞面积和胰高血糖素表达情况比较

注：与NC组比较，△P<0.05；与IGT组比较，*P<0.05；同组间干预前后比较，#P<0.05

注：A为干预前NC组，B为干预前IGT对照组，C为干预前Si组，D为干预后NC组，E为干预后IGT对照组，F为干预后Si组

图1 各组大鼠干预前后胰岛α细胞胰高血糖素蛋白表达情况

3 讨 论

IGT是糖尿病前期最常见的表现，几乎是糖尿病的必经阶段。研究证明，IGT阶段已存在血清胰高血糖素升高，胰岛α细胞增生情况。因此，对糖尿病前期患者进行干预，对于抑制胰岛α细胞增生及逆转胰岛细胞功能，阻止其发展成糖尿病具有重要意义。

肠促胰素属于胃肠道激素，是由胃肠道内分泌细胞分泌，主要包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖的促胰岛素分泌多肽(GIP)，两者均可通过促进胰岛素分泌降低血糖，且不会使患者出现低血糖[6]。但GLP-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶-Ⅳ水解，半衰期较短。DPP-4抑制剂能够有效抑制二肽基肽酶-Ⅳ的活性，从而提高GLP-1和GIP水平，延长其作用时间，促进胰岛素的分泌[7-8]。此外，DPP-4抑制剂还能通过抑制GLP-1和GIP的降解，间接促进胰岛β细胞增殖，有抑制食欲、延缓胃排空的作用。其还能通过抑制肝糖原输出、增加葡萄糖利用等方式增强胰岛素敏感性。本研究结果显示，西格列汀干预4周后，Si组大鼠无论是与干预前比较，还是与IGT对照组比较，体质量更小，尤以下腹部最为明显，动作更加敏捷，反应更加灵敏。此外，Si组大鼠2 hPG、TG、TC水平也明显下降，提示西格列汀不仅能够减轻IGT大鼠的体质量，改善糖尿病前期的临床特征，还能降低餐后血糖，改善脂代谢紊乱。这进一步表明，西格列汀可能具有阻止糖尿病前期向糖尿病发展的功能，这与国内相关研究结果一致[9-10]。

西格列汀主要通过增加血清GLP-1水平发挥生理作用。(1)GLP-1可直接促进胰岛素的分泌，从而提高血清胰岛素水平[11]。其通过增加胰岛素mRNA的稳定性、上调胰岛素的基因转录和生物合成等方式，补充β细胞的胰岛素储存量，防止β细胞耗竭[12]。(2)GLP-1可有效抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素。有研究表明，GLP-1不仅能降低2型糖尿病患者的血清胰高血糖素水平，还可改善1型糖尿病(T1DM)患者的胰岛α细胞功能。FARGREN等[13]的研究显示，T1DM患者在接受维格列汀治疗4周后，餐后血清胰高糖素水平(餐后120 min胰高糖素曲线下面积)明显低于接受安慰剂治疗的人群。本研究结果显示，西格列汀干预IGT大鼠后，免疫组织化学检测胰岛α细胞胰高血糖素阳性面积百分比低于IGT对照组，免疫荧光标记胰岛α细胞胰高血糖素弱于IGT对照组，胰岛中央部分布减少，血清胰高血糖素水平降低，提示西格列汀干预后，胰岛α细胞数量减少，胰高血糖素的合成和分泌减少，说明西格列汀可以改善IGT阶段胰岛a细胞数量和分泌功能。(3)GLP-1主要通过与其受体结合发挥生物学效应。研究证实，胰岛a细胞存在GLP-1受体。研究显示，GLP-1可直接激活激酶A(PKA)，继而抑制胰岛a细胞上的N型钙离子通道，小幅度增加细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平，减少胰高血糖素的胞吐作用，抑制胰高血糖素的分泌。(4)GLP-1能促进胰岛素分泌。研究发现，在胰岛素信号通路参与抑制胰高血糖素分泌的过程中，GLP-1可通过胰岛素、生长抑素等旁分泌途径作用于胰高血糖素。目前关于GLP-1抑制胰高血糖素分泌是否通过胰岛素介导的结论不一：有学者表示GLP-1可诱导胰岛素基因的转录，促进胰岛素的成熟和分泌，通过胰岛素间接抑制胰高血糖素的分泌；也有学者证实GLP-1不能直接抑制胰高血糖素分泌，必须有生长抑素底物-2介导，提示生长抑素可能作为中间桥梁介导GLP-1抑制胰高血糖素分泌的作用。GLP-1与胰岛a细胞上的GLP-1受体结合，刺激生长抑素的分泌增加；升高的生长抑素作用于胰岛a细胞，抑制胰高血糖素的分泌。(5)GLP-1改善胰岛素抵抗。研究证实，高糖高脂饮食诱导的IGT及2型糖尿病阶段已经存在胰岛a细胞胰岛素抵抗。GLP-1可能通过改善胰岛素抵抗，抑制胰高血糖素的分泌。研究显示，IGT阶段存在胰岛素抵抗状态，给予GLP-1受体激动剂Exendin-4干预后，胰岛素抵抗改善，全身组织对胰岛素的敏感度增加，糖负荷后胰岛a细胞的功能恢复，感知胰岛素作用能力增强，胰高血糖素分泌被抑制。

综上所述，西格列汀可下调胰岛α细胞面积及胰高血糖素蛋白表达，降低餐后血糖和胰高血糖素水平。

[1]LIAN F,LI G,CHEN X,et al.Chinese herbal medicine Tianqi reduces progression from impaired glucose tolerance to diabetes:a double-blind,randomized,placebo-controlled,multicenter trial[J].J Clin Endocrinol Metab,2014,99(2):648-655.

[2]YANG W,ZHAO W,XIAO J,et al.Medical care and payment for diabetes in China:enormous threat and great opportunity[J].PLoS One,2012,7(9):e39513.

[3]XY Y,WANG L,HE J,et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA,2013,310(9):948-959.

[4]徐瑜,毕宇芳,王卫庆,等.中国成人糖尿病流行与控制现状--2010年中国慢病监测暨糖尿病专题调查报告解读[J].中华内分泌代谢杂志,2014,30(3):184-186.

[5]杨远行,郗光霞,孙启政,等.艾塞那肽对糖耐量减低大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4表达的作用[J].中华内分泌外科杂志,2016,7(3):187-190.

[6]母义明.DPP-4抑制剂类药物在2型糖尿病管理中的药物经济学评估[J].中华内分泌代谢杂志,2014,30(6):541-544.

[7]宋崟,任耘.DPP-4抑制剂单药治疗2型糖尿病的临床疗效及安全性[J].天津药学,2014,26(1):62-64.

[8]靳淇,陈海燕,孔俭.DPP4抑制剂西格列汀对2型糖尿病患者的治疗作用[J].中国老年学杂志,2013,33(17):4105-4106.

[9]杜雅芹,成旭东.DPP-4抑制剂(西格列汀)对糖尿病前期人群的治疗效果与安全性分析[J].现代仪器与医疗,2015,21(5):61-63.

[10]吕霄,赵猛,凌宏威,等.西格列汀对糖尿病前期人群干预效果[J].中国老年学杂志,2014,34(1):26-29.

[11]陈莉明.二肽基肽酶Ⅳ抑制剂类口服降糖药的药化性质和药理活性综合比较分析[J].中华糖尿病杂志,2016,8(8):508-510.

[12]赵超,刘昕,崔进,等.GLP-1对2型糖尿病β细胞作用机制的研究[J].中国医学创新,2013,10(24):148-150.

[13]FARGREN J,PERSSON M,SCHWEIZER A,et al.Vildagliptin reduces glucagon during hyperglycemia and sustains glucagon counterregulation during hypoglycemia in type 1 diabetes[J].J Clin Endocrinol Metab,2012,97(10):3799-3806.