PtrDREB28转录因子的克隆及抗逆性1)

刘海妹 陈韵琳 李成浩

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

在自然条件下，由于植物体自身不能移动导致其生存环境相对固定，因此，干旱和高盐等逆境条件成为干扰植物正常生长发育的主要因素[1]。那么为了维持植物体自身在逆境条件下的正常生长和发育，其通过建立各种胁迫应答机制来抵抗各种逆境条件[2]。目前，许多草本植物中响应胁迫应答的转录因子基因已经被克隆出来[3]，如AP2/EREBP、ABRE、MYB/C和NAC等，其中AP2/EREBP转录因子是植物体特有的，并且在逆境应答胁迫中起着至关重要的作用。按照DNA结合不同的结构域AP2/EREBP类转录因子分为AP2、DREB、ERF、RAV和其他等5个亚族[4]。其中DREB亚族又分为6个亚群(A-1～A-6)。A-2亚群的DREB转录因子可通过与DRE顺式作用原件结合，进而调控响应干旱、高盐等逆境胁迫相关的基因表达[5]。但目前对于该类转录因子的研究和报道大多数还仅限于拟南芥、水稻等草本模式植物中，而以木本植物为对象的研究较少。杨树分布广、适应性强、生长速度快、遗传转化率较高[6]，是基因工程重要的受体树种之一。我国作为世界上盐碱地面积最大的国家之一，研究杨树应答盐胁迫的分子机理，筛选出耐盐关键基因，对进一步利用基因工程技术改良杨树耐盐性具有重要作用。

本研究从毛果杨中克隆A-2亚群DREB转录因子基因PtrDREB28基因，构建植物过表达载体，利用根癌农杆菌介导法进行大青杨遗传转化，得到转基因大青杨株系。通过非生物胁迫及生理指标的测定初步确定得到耐高盐的转基因大青杨株系。虽然关于DREB转录因子提高植物抗逆性的报道很多，但目前来看DREB转录因子的过表达也很容易引起转基因植株矮化或生长延缓现象[7]，而本研究最大的优势是PtrDREB28转录因子基因不但提高了杨树的耐盐能力，而且不会影响杨树的正常生长。

1 材料与方法

用于提取植物总RNA的毛果杨(PopulustrichocarpaTorr. & Gray)取自东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。大肠杆菌感受态DH5α和根癌农杆菌EHA105为本实验室保存，克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司，植物表达载体为pBI121，携带35S CAMV启动子、绿色荧光蛋白基因(gfp)和卡那霉素筛选标记基因(npt-II)。

1.1 PtrDREB28基因编码区引物序列

根据实验室前期对PtrDREB28转录因子所在的DREB亚族的生物信息学分析，并对野生型毛果杨进行了不同时间的胁迫处理，发现该基因被诱导，推测其功能与响应非生物胁迫相关。PtrDREB28基因在NCBI中检索(登录号为：XM_002324616.1)，根据检索的ORF序列设计引物，上游引物F：5’-ATGGTGCAGTCAAAAAAGTT-3’，下游引物R：5’-CTAAAGAAAAAGGCTACCGTC-3’。CTAB法提取毛果杨植株的总RNA，用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，用胶回收试剂盒和DNA纯化试剂盒进行胶回收和纯化，与pMD18-T Vector载体链接，转化大肠杆菌感受态细胞，接种到含氨苄霉素的LB固体培养基平板上，37 ℃倒置过夜培养，挑取单克隆菌落进行菌液PCR检测和测序。

1.2 植物过表达载体pBI121-PtrDREB28-GFP的构建方法

设计带有XbaⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，上游引物为F:5’-GCTCTAGAGATGGTGCAGTCCAAGAAG-3’，下游引物为R：5’-GCGTCGACGAAGAAAAAGGCTACC-3’。提取pMD18-T-PtrDREB28的质粒，进行PCR扩增目的片段。利用XbaⅠ和SalⅠ的特异性酶切位点分别对过表达载体pBI121和纯化的目的片段进行双酶切，用T4-DNA连接酶对两者进行连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，新的重组质粒经过菌液PCR检测和卡那霉素筛选后，获得pBI121-PtrDREB28-GFP植物过表达载体，用电击法将其转化到根癌农杆菌感受态细胞中。

1.3 亚细胞定位

用质粒小提试剂盒提取pBI121-PtrDREB28-GFP和pBI121-GFP质粒备用。撕取新鲜洋葱的倒数第2～4层鳞茎内表皮，用基因枪(Biolistic® PDS-1000)将pBI121-PtrDREB28-GFP质粒和对照质粒DNA(pBI121-GFP)转化到洋葱表皮细胞。培养皿室温下暗培养12～48 h后，将激光共聚焦扫描显微镜激发波长调整为488 nm进行观察。

1.4 农杆菌介导法转化大青杨

将活化培养制备好的工程菌4 000 r/min离心5 min，1/2MS液体培养基重悬。在无菌工作台中，剪取大青杨组培苗上部第3～4片叶片，切除叶尖1/2部分，放入菌液中侵染20 min。叶子用无菌滤纸吸干菌液后，在共培养培养基(1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)中共培养2 d。然后用添加200 mg/L的头孢霉素水清洗3～5次，滤纸吸去表面水分后，放入添加200 mg/L cef和50 mg/L Kan的筛选培养基置于暗处进行筛选培养，诱导愈伤组织生成。待愈伤组织足够大将其移至光下培养，待大青杨丛生芽长成苗，放入生根培养基(不添加植物生长调节物质的1/2MS培养基)中，生根培养基中含50 mg/L Kan和200 mg/L Cef。提取转基因大青杨DNA和RNA(CTAB法)，进行分子检测。

1.5 盐胁迫下转基因大青杨幼苗的抗逆性

将野生型大青杨和转基因大青杨株系L2、L8和L15的组培苗各取5～8株在添加80 mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基中培养2周后，观察并比较野生型和转基因株系的生长与生根情况，对其耐盐性进行评价，每组试验进行3次生物学重复。

1.6 盐胁迫下转基因大青杨生理指标的测定

丙二醛(MDA)质量摩尔浓度的测定：对照和过表达转基因大青杨株系L2、L8和L15组培苗，80 mmol/L NaCl胁迫一周后分别取植株上部第3片叶片，称取鲜样0.1 g，利用分光光度计法并参照Dhindsa et al.[8]的实验方法测定丙二醛质量摩尔浓度，每次测定进行3次生物学重复。

相对电导率的测定：将在正常条件下组织培养2周后的野生型和转基因大青杨株系分别进行80 mM NaCl胁迫一周，然后分别取野生型和转基因植株同样大小的叶片，快速称取鲜样3份，每份0.1 g，分别加入50 mL的蒸馏水，3～5 h后，用电导仪测其电导值S1，将玻璃瓶置于水浴锅中90 ℃热浴30 min，冷却到室温，测其电导值S2，相对电导值为S1/S2，进行3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 PtrDREB28基因编码区的克隆

以反转录产物为模板，PCR扩增出PtrDREB28目的片段(图1)，约为621 bp，与预期吻合，将该段目的片段回收后与pMD18-T载体连接，经菌液PCR验证和测序结果表明该基因已经克隆到pMD18-T载体上。

2.2 植物过表达载体pBI121-PtrDREB28-GFP的构建

新获得的重组质粒经菌液PCR验证后得到大小约为621 bp的片段(图2)，与预期结果吻合，获得植物表达载体pBI121-PtrDREB28-GFP。电转农杆菌后，经菌液PCR鉴定后保存菌液用于后续试验。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.PtrDREB28基因PCR扩增产物。

2.3 转录因子的亚细胞定位

质粒pBI121-PtrDREB28-GFP和阳性对照质粒pBI121-GFP利用基因枪法转化洋葱表皮细胞后，激光共聚焦显微镜下观察洋葱表皮细胞中的荧光信号。结果表明(图3)，pBI121-GFP在整个细胞内都有GFP绿色荧光分布，pBI121-PtrDREB28-GFP只在洋葱表皮细胞核内有绿色荧光，说明PtrDREB28转录因子定位在细胞核。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.pBI121-PtrDREB28-GFP菌液PCR产物。

图2 pBI121-PtrDREB28-GFP植物表达载体构建

图3 PtrDREB28基因的亚细胞定位

2.4 PtrDREB28基因过表达转基因大青杨的筛选与检测

把构建好的植物表达载体pBI121-PtrDREB28-GFP用农杆菌介导法转化到野生型大青杨。待在抗性培养基上筛选后得到的转基因植株生根生长状态统一时，剪取每个株系同一部位的叶片2～3片分别提取DNA进行PCR检测(图4-A)，检测时使用pBI121-PtrDREB28-GFP质粒作为阳性对照，使用野生型大青杨DNA作为阴性对照，检测结果显示除13号以外的所有株系都有目的条带。初步说明PtrDREB28基因已经成功插入到大青杨基因组中。对转基因植株的叶片提取RNA进行RT-PCR检测(图4-B)，说明该基因能够过量表达，共获得16个转基因株系。其中挑选2、8、15号用于后续实验。

2.5 盐胁迫下野生型大青杨与转基因大青杨幼苗的抗逆性比较

对组培苗的生长发育性状的比较结果发现，在正常培养条件下，转基因株系和野生型大青杨无显著差异。将正常培养20 d的转基因株系和野生型植株的组培苗，测量根长和株高后，剪取植株上部带有3～4片叶子的2 cm左右茎段，转到添加80 mmol/L NaCl的1/2MS培养基培养20 d后，观察叶片受损程度和根系生长情况，如图5结果表明：转基因株系L2、L8、L15号和野生型大青杨叶片均受损，但野生型叶片大部分变黑，而转基因株系的叶片只是轻微受损，大部分仍然保持绿色；转基因植株的根系明显较野生型植株根系生长旺盛；通过统计测量根长长度(见表1)，结果表明：在正常生长条件下，转基因株系和野生型植株的根长基本一致，经80 mmol/L NaCl胁迫处理20 d后，虽然转基因株系和野生型植株根部生长均受抑制，但转基因株系根长显著高于野生型植株；通过统计测量株高(见表2)，结果表明：在正常生长条件下，转基因株系和野生型植株的株高基本无差异，经80 mmol/L NaCl胁迫处理20 d后，虽然转基因株系和野生型植株生长均受抑制，但转基因株系显著高于野生型植株；以上结果表明过量表达PtrDREB28基因提高了转基因大青杨的耐盐性。

A.转基因植株叶片DNA水平PCR检测;B.转基因植株叶片RNA水平PCR检测;M.DL2000 DNA Marker;+.阳性对照;-.阴性对照;1-22.转基因植株叶片DNA;1-12,14-22.转基因植株叶片cDNA。

图4转基因植株叶片分子水平PCR检测

图5 80 mmol/L NaCl胁迫处理下野生型大青杨和转基因大青杨表型

表1 80 mmol/L NaCl胁迫处理下野生型大青杨和转基因大青杨根长统计 cm

注：表中数据为“平均值±标准误”；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.6 盐胁迫下野生型大青杨和转基因大青杨生理指标的测定

2.6.1 丙二醛(MDA)质量摩尔浓度的测定

丙二醛质量摩尔浓度比较结果见表3：在正常条件下培养的野生型大青杨和转基因大青杨株系的MDA质量摩尔浓度基本一致，但在同样的盐胁迫处理下，3个转基因株系的MDA质量摩尔浓度均显著低于野生型，表明转PtrDREB28基因的大青杨抗逆性显著高于野生型。

表2 80mmol/L NaCl胁迫处理下野生型大青杨和转基因大青杨株高统计 cm

注：表中数据为“平均值±标准误”；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.6.2 相对电导率的测定

相对电导率是衡量细胞膜透性情况的一个生理指标。我们通过测定相对电导率比较盐胁迫下野生型和转基因大青杨细胞的损坏程度。结果见表4，在盐胁迫处理前，转基因与野生型植株的相对电导率差异不大，在盐胁迫后，野生型植株的相对电导率显著高于转基因株系，说明通过PtrDREB28基因的过表达使得转基因植株在盐胁迫下，细胞膜的受损伤程度降低，盐胁迫耐受能力得到提高。

表3 80mmol/L NaCl胁迫处理下大青杨叶片MDA质量摩尔浓度的测定 mol·g-1

注：表中数据为“平均值±标准误”；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表4 80 mmol/L NaCl胁迫处理下大青杨叶片的电导率测定 %

注：表中数据为“平均值±标准误”；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

研究发现DREB类转录因子可以显著提高植物的抗逆性[9]。本研究根据杨树DREB序列，利用RT-PCR技术从毛果杨中克隆得到了A-2亚群DREB转录因子PtrDREB28基因。构建植物过表达载体，通过亚细胞定位证实PtrDREB28是一个核蛋白，与前人研究的转录因子亚细胞定位特性符合[10]。

A-2亚群的DREB类转录因子在植物应答干旱、高盐等非生物胁迫过程中发挥重要作用。为了研究杨树A-2亚群DREB类转录因子PtrDREB28的功能，本文构建了PtrDREB28基因融合GFP表达载体,并成功获得过表达转基因株系，同时发现其转基因株系组培苗在盐胁迫下的生长状况显著优于野生型。为了进一步研究PtrDREB28过表达转基因杨树在盐胁迫耐受性的影响，将转基因株系和野生型植株在相同环境条件下进行同样的盐胁迫处理，通过测定其各自体内MDA质量摩尔浓度和相对电导率来比较细胞受损伤程度[11]，发现转基因株系的细胞受损程度显著低于野生型植株，表明PtrDREB28基因在大青杨中过表达可显著提高植株的耐盐性。有研究表明，在草本植物拟南芥中，A-2亚群DREB转录因子家族中的AtDREB1A过表达转基因小麦的耐盐性显著提高[12]；周伟等[13]将山葡萄VaDREB基因转化到拟南芥中，转基因植株的耐盐性显著提高。但Liu et al.[14]研究发现，拟南芥AtDREB2A基因能响应盐胁迫，但过表达拟南芥植株的耐盐性并没有得到提高。初步推测不是所有能响应胁迫的DREB类转录因子都能提高植物的抗逆性，不同物种中DREB亚族的不同基因，其对非生物胁迫的应答机制可能不同。

许多DREB亚族的基因在植物体中过表达后，转基因植株的抗逆性得到提高，但有时也会表现出严重的生长滞后现象，这对于植物生长发育十分不利。已有研究表明，过表达OsDREB1A转基因拟南芥在低温和盐胁迫下抗性显著提高，并表现出严重的生长迟缓和矮化[15]；也有研究指出，在大豆中过表达MsDREB1基因，转基因植株在干旱胁迫下抗性显著提高，但却出现明显的发育滞后现象。而本研究中，PtrDREB28转基因大青杨组培苗在盐胁迫下的生长状态显著好于野生型，值得一提的是，与对照植株相比，转基因植株在正常生长条件下并没有出现生长迟缓和植株矮化现象，这一发现对植物基因工程技术育种具有重要意义，但其具体抗逆机理还有待进一步研究。

本研究中我们分析了PtrDREB28基因在大青杨中的过量表达在植物抗逆方面的作用，发现PtrDREB28转基因大青杨植株耐盐性提高，表明该基因在植物高盐胁迫应答中起着重要的调控作用，并且不会影响植株的正常生长发育，为今后利用植物基因工程技术提高杨树抗逆性提供了优质基因资源。

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