趋化因子-8对高糖诱导人间充质干细胞损伤的保护作用

沈 雷 沙 峰 孙 权 张 鹏 孙石柱 张晓东 姚立杰 李静平

(齐齐哈尔医学院解剖学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

糖尿病及其并发症已经成为影响中国发展的重要疾病之一〔1～4〕。存在于骨髓、脂肪等组织中的间充质干细胞(MSC)具有来源广泛、免疫低、多分化性等特点，既对组织损伤修复具有很好的疗效，又避免了医学伦理问题，是重要的治疗性细胞〔5〕。但是高血糖环境会对移植的细胞造成严重的损伤〔6〕，研究发现，缺氧能促使宫颈癌细胞高表达趋化因子(CXCL)-8，发挥对抗缺氧、促进肿瘤细胞增殖的效果〔7〕，提示CXCL-8在缺氧环境下，可以发挥较强的促进细胞归巢和血管新生的作用。但是在糖尿病性血管病变导致的高糖环境中，CXCL-8是否也会发挥抑制MSC损伤、促进细胞增殖等研究却鲜见报道。本文探讨CXCL-8对高糖诱导MSC损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1细胞来源及实验分组 人骨髓MSC购于广州赛业干细胞生物公司。转染pcDNA3.1-CXCL-8者为CXCL-8-MSC组、仅转染pcDNA3.1质粒者为pcDNA3.1组、无任何刺激者为对照组、若在CXCL-8-MSC组添加100 μmol/L Triciribine则为Akt抑制剂组。

1.2主要试剂和仪器 胎牛血清(FBS，以色列Bioind公司)，青链霉素(碧云天生物公司)，L-DMEM培养基(美国Hyclone公司)，葡萄糖(美国Sigma公司)，Triciribine(美国Sigma公司)，DH5α大肠杆菌和pcDNA3.1质粒由本教研室保存提供，LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)，小鼠抗人CXCL-8(美国Santa公司)，CCK8细胞增殖试剂盒(日本同仁化学研究所)，小鼠抗人Caspase-3抗体、p-Akt抗体、p-STAT3抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG(英国Abcam公司)，β-actin(英国Abcam公司)，血管内皮生长因子(VEGF)-酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(美国RD公司)，Emax酶标仪(美国Molecular Devices公司)，BX50型显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 用含10%胎牛血清，1 μmol/L青霉素和100 U/ml链霉素的L-DMEM基础培养基培养MSC；在L-DMEM基础培养基中添加30 mmol/L葡萄糖为MSC高糖培养基。分别在MSC高糖培养基中培养CXCL-8-MSC组、pcDNA3.1组、对照组、Akt抑制剂组MSC。

1.3.2CXCL-8基因转染MSC及其鉴定 大连宝生物有限公司设计人CXCL-8基因引物。按5×104/ml MSC添加500 μl 1% LipofectamineTM2000比例进行转染，利用G418筛选阳性克隆。37℃，5%CO2孵育48 h，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，使用小鼠抗人CXCL-8(1∶150)抗体孵育，二抗使用TRITC标记山羊抗小鼠IgG(1∶250)，鉴定CXCL-8的表达。

1.3.3CCK8法检测细胞增殖情况 按MSC分组情况，接种2×104MSC于96孔板，用100 μl培养基培养48 h，每孔加入10 μl CCK8，孵育4 h，使用Emax酶标仪，450 nm波长测定每个样品吸光度(OD值)。

1.3.4Western印迹检测Caspase-3、p-Akt和p-STAT3蛋白表达 按照实验分组情况，培养每组3×106细胞，加入RIPA细胞裂解液，4℃下12 000 r/min，提取蛋白液；取20 μg各组蛋白样品，SDS-PAGE凝胶电泳70 min；然后转至硝酸纤维素薄膜；封闭液中封闭60 min；添加小鼠抗人Caspase-3(1∶250)、p-Akt(1∶200)、p-STAT3(1∶250)等抗体，4℃过夜，使用HRP标记山羊抗小鼠IgG(1∶200)，室温孵育80 min；电光学发光(ECL)试剂等步骤检测蛋白表达，Image-Pro Plus软件分析各带吸光度值作定量计算，β-actin为内参对照〔8〕。

1.3.5ELISA检测VEGF蛋白含量 按照实验分组情况，培养5×106各组MSC，0.01 mol/L PBS清洗，然后以含0.1% FBS的各组细胞培养基继续培养24 h，收集各组细胞的上清液，ELISA试剂盒进行检测VEGF含量。

1.4统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t或χ2检验。

2 结 果

2.1转染CXCL-8的表达 MSC内转染CXCL-8蛋白呈红色荧光，见图1；ELISA法检测细胞上清液CXCL-8蛋白含量，发现CXCL-8-MSC组CXCL-8蛋白含量〔(1.31±0.18)pg/ml〕是pcDNA3.1组〔(0.78±0.21)pg/ml〕的1.68倍(P<0.01)，而Akt抑制剂组CXCL-8蛋白含量〔(0.94±0.14)pg/ml〕是CXCL-8-MSC组的0.71倍(P<0.01)。

2.2高糖环境下CXCL-8对MSC增殖和凋亡的影响 在高糖环境下，CXCL-8-MSC组细胞增殖OD值(1.15±0.17)是pcDNA3.1组(0.81±0.12)的1.43倍(P<0.01)，Akt抑制剂组MSC增殖OD值(0.87±0.15)是CXCL-8-MSC组的0.76倍(P<0.01)；CXCL-8-MSC组Caspase-3蛋白的相对吸光度(0.81±0.04)仅为pcDNA3.1组(1.09±0.06)的0.75倍，而Akt 抑制剂组Caspase-3蛋白相对吸光度(1.10±0.02)是CXCL-8-MSC组的1.37倍(P<0.01)，见图2。

2.3各组MSC中p-Akt、p-STAT3和VEGF蛋白的变化 Western印迹发现，高糖条件下CXCL-8-MSC组p-Akt、p-STAT3蛋白分别是pcDNA3.1组的2.03和2.11倍(P<0.01)，而Akt抑制剂组p-Akt、p-STAT3蛋白分别是CXCL-8-MSC组的0.37和0.53倍(P<0.01)，CXCL-8-MSC组p-Akt与Akt、p-STAT3与STAT3分别比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图3，表1。

图1 MSC内转染CXCL-8的鉴定(免疫荧光染色，×100)

1～5：正常培养基组、对照组、pcDNA3.1组、CXCL-8-MSC组、Akt抑制剂组图2 各组Caspase-3蛋白表达

1～4：对照组、pcDNA3.1组、CXCL-8-MSC组、Akt抑制剂组图3 各组MSC中p-Akt/Akt、p-STAT3/STAT3蛋白的表达

表1 高糖环境下Caspase-3蛋白的相对吸光度

与pcDNA3.1组比较：1)P<0.01；与CXCL-8-MSC组比较：2)P<0.01;与CXCL-8-MSC组Akt比较：3)P<0.01；与CXCL-8-MSC组STAT3比较：4)P<0.01

2.4各组MSC中VEGF蛋白的变化 CXCL-8-MSC组细胞上清液中VEGF蛋白〔(1.31±0.11)pg/ml〕是pcDNA3.1组〔(0.62±0.07)pg/ml〕的2.12倍，但是Akt抑制剂组VEGF含量〔(0.79±0.04)pg/ml〕是CXCL-8-MSC组的0.61倍(P<0.01)。

3 讨 论

发生在糖尿病患者下肢的顽固性皮肤溃疡为糖尿病足(DF)〔9〕。众多细胞因子、细胞、细胞外基质、免疫细胞等因素的相互作用，参与了正常皮肤伤口的愈合过程〔10〕，然而，糖尿病性神经、血管病变、细胞功能下降是DF溃疡延迟愈合甚至不愈合的主要病理变化〔9〕。近年出现的高压氧法、抗感染等各种治疗手段被逐渐用于治疗DF溃疡，但是效果不甚理想〔9〕。

MSC属于多能干细胞，在骨关节、心血管、神经等系统的许多疾病有广泛应用〔5〕，虽然对于DF这种兼有血管、神经等混合性病变而言，MSC移植疗法尤为合适，但是高血糖环境会导致MSC等细胞活性降低，组织修复功能减弱〔6〕。Liu等〔7〕研究发现，在宫颈癌肿瘤组织，随着瘤体不断增大，肿瘤组织血管新生减弱，形成局部缺氧环境，持续的缺氧会刺激HeLa、SiHa细胞产生大量CXCL-8等趋化因子，致使HeLa和SiHa等肿瘤细胞凋亡降低，加速肿瘤组织血管新生，改善缺氧条件，肿瘤呈现增生或转移等趋势，表明CXCL-8具有对抗缺氧、招募细胞归巢、促进血管新生作用〔11〕。

Eming等〔12〕在正常皮肤伤口愈合的过程中研究发现，CXCL-8可以与细胞表面的细胞超化因子受体(CXCR)1结合，招募脂肪组织、血液中的MSC、成纤维细胞等细胞趋化到伤口区域，参与损伤修复，并对动员血管内皮细胞活性，加速血管新生有重要效果，然而在DF区域，巨噬细胞、成纤维细胞等细胞分泌的CXCL-8等细胞因子大量减少，宿主细胞归巢能力降低，伤口迁延愈合〔10〕，在高糖环境下，CXCL-8对MSC等细胞的作用效果如何，却鲜见研究。

本实验发现，成功转染CXCL-8的MSC会分泌CXCL-8蛋白，CXCL-8结合于MSC细胞膜表面的CXCR1/2，会激活Akt等信号通路而发生一系列信号传递效果，虽然添加Akt抑制剂阻滞了Akt信号通路的传导，但是Akt抑制剂组MSC分泌的CXCL-8依然比CXCL-8-MSC组表达降低，这可能是由于CXCL-8对MSC的作用尚存在Erk等其他分子作用机制〔13〕，相关机制还有待深入研究。此外，我们还发现，高糖环境可以使MSC等细胞的增殖降低，Caspase-3凋亡蛋白增多等现象，与Sargent〔6〕的研究类似。

2014年Nature杂志报道磷酸化Akt蛋白可以导致下游mTOP、STAT3等信号通路的活化〔14〕。本文也发现，CXCL-8转染MSC后，Akt、STAT3磷酸化蛋白(p-Akt、p-STAT3)明显升高，可能是由于MSC高表达的CXCL-8结合于MSC表面的CXCR1/2〔15〕，通过PI3K-Akt信号通路，导致STAT3磷酸化，激活PI3K-Akt-STAT3信号通路，使STAT3下游的VEGF基因活化〔16〕。在CXCL-8-MSC组添加Akt抑制剂后，发现STAT3蛋白和VEGF蛋白明显降低，间接证明了Akt-STAT3信号通路在CXCL-8作用于MSC，促使MSC旁分泌VEGF等细胞活性因子的作用。Liang等〔17〕研究发现，VEGF可以抑制糖尿病环境下MSC凋亡，对糖尿病性心脏病具有改善心肌功能、促进血液循环的重要作用。本实验也发现，高糖环境下，CXCL-8刺激MSC旁分泌VEGF蛋白增多，抑制了Caspase-3凋亡蛋白表达，提高了细胞增殖，对抑制高糖导致的MSC损伤具有重要保护作用。综上，CXCL-8转染的MSC可以发挥抗高糖导致的MSC损伤，对MSC具有保护性作用。如果移植CXCL-8转染的MSC到糖尿病者体内，高表达的CXCL-8还会促进体内细胞归巢〔14〕，加快修复糖尿病性组织损伤。

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