一株磺化沥青降解菌的筛选鉴定及降解特性研究

幸晶晶 ， 马立安 ， 余维初

（1.石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京102206；2.长江大学生命科学学院，湖北荆州434025；3.长江大学化学与环境工程学院，湖北荆州434025）

0 引言

钻井废水成分复杂、水质多变、排放点分散，其主要水质表征为：COD浓度高，废水可生化性差；色度较高；固体悬浮物含量较多[1-3]。三磺钻井液体系是国内油田普遍采用的一种性能优良、价格低廉的耐高温型钻井液体系，主要用于井深达到2000～3000 m以上时的深井钻井过程，目前在国内各油田都有大量的使用。三磺钻井液体系就是添加剂主要组成为磺化酚醛树脂（SMP）、磺化褐煤（SMC）、磺化烤胶（SMK）、磺化沥青等的钻井液体系，也称为磺化钻井液体系[4]。

磺化沥青是一种以石油烃基化合物为原料经过硫酸等物质进行复杂的化学处理而得到的一种改性的高分子化合物。是经过磺化、氧化和乳化等改性化学处理得到的产品[5-8]。该实验旨在研究三磺钻井液体系中的磺化沥青的降解菌及降解特性。

对于油田钻井废液的处理方法主要有物化法、化学法、生物法组合和工艺处理法4大类[9-11]。其中物化法、化学法及工艺处理法在处理过程中存在造价过高或处理不达标及造成二次污染等其他问题[12-18]。随着微生物处理技术的深化研究和工程实践经验的积累，生物处理技术在有毒、有害有机工业废水的治理中已得到了广泛的应用[19-22]。张淑侠等[23]针对聚磺钻井液废水中有机物含量高、降解难度大的特点，研究了用高效复合菌剂 BS5 处理经生化预处理工艺后排出的废水， 当优势菌剂加量为 0.5 g·L-1， 曝气量为 0.25 L·min-1， 污泥沉降比为25%～35%时， COD去除率大于87%。冯栩等[24]通过从受钻井废水污染的土壤样品中筛选菌株进行生物处理实验[25]，并加入20 mg·L-1的硫酸铵来提高降解率，用其处理COD范围为1369～1655 mg·L-1的钻井液废水，通过曝气作用，使得有机物去除率达到42%，且运行过程中耐冲击负荷性和稳定性均较好。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

菌种来源：新疆克拉玛依油田磺化钻井液，钻井口附近离地表15～20 cm的油田钻井液，进行多点取样后装入无菌袋存于实验室4 ℃冰箱中密封保存。

磺化沥青：由重庆大方提供。

1.1.2 培养基

基础培养基 ： 5 g 牛肉膏、 10 g 蛋白胨、5 g NaCl 、1 L 蒸馏水、pH 值 为 7.0。

无 机 盐 培 养 基 ： 0.5 g KCl、1.5 g NaNO3、1 g K2HPO4、 0.5 g MgSO4、 1.5 g （NH4）2SO4、5 g NaCl、 0.01 g CaCl2、 0.01 g FeSO4、 1 L H2O。

富集驯化/筛选降解培养基：无机盐培养基加入0.5%的磺化沥青。

分离培养基：富集驯化/筛选降解培养基加入50%的基础培养基，2%琼脂。

扩大培养基：富集驯化/筛选降解培养基加入50%的基础培养基。

1.2 方法

1.2.1 菌种的富集、驯化

分别称取各污染土壤1 g，加入到以磺化沥青为唯一碳源的富集驯化培养基中进行富集、驯化。培养条件为 35 ℃、150 r/min，培养 5 d 后进行转接，吸取5 mL驯化菌液，加入到新的筛选培养基中进行传代驯化。驯化周期为5 d，连续驯化5个周期后，加入到分离扩大培养基进行扩大培养，获得以磺化沥青为唯一碳源生长的混合菌液。

1.2.2 菌种的分离、纯化、筛选

取混合菌液，10倍系列稀释涂布于分离培养基上，35 ℃培养获得单菌落。观察菌落生长情况，根据菌落颜色、形态、大小、边缘特征等挑选不同类型的单菌落，命名为X1-n。再进行划线分离、纯化，镜检，获得纯种单菌落，回接筛选培养基中筛选降解效果，对降解效果好的纯种单菌落做生理生化及分子鉴定。

1.2.3 菌种的生理生化及分子鉴定

（1）生理生化鉴定：参考《伯杰细菌手册》进行初步鉴定。

（2）分子生物学鉴定：用接种环挑取少量菌体，置于1.5 mL离心管中，加入30 μL去离子水，振荡使菌体分散，盖紧离心管并用封口膜密封，置于微波炉中使用中火加热2 min，加热后立即将离心管冰浴 2 min，然后 12 000 r/min，离心 1 min，吸上清液置于-20 ℃备用。以提取细菌DNA为模板，通用引物（27F和1492R）扩增16S rRNA基因，PCR 反 应 体 系 为（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 27F/1492R（10 μmoL）各 2 μL，模板 DNA 3 μL，ddH20 18 μL。PCR 反应程序为 ：94 ℃ 4 min ；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30个循环，72 ℃10 min。PCR产物经电泳检测后，交至武汉生工测序公司测序。测序结果在NCBI中进行比对分析，并通过MEGA 5.0构建系统发育树。

1.2.4 菌种的降解特性研究

1）单因素实验。

①温度：准确量取50 mL的筛选培养基于150 mL的锥形瓶中，接入5%的扩大培养菌液，分别放在25、28、31、34、37 ℃（分别设为 W1、W2、W3、W4、W5），转速为 150 r/min 的恒温摇床中，培养7 d，5个周期，分别测定OD600 nm的吸光值。研究该菌种的最佳生长温度。

②pH值：准确量取50 mL的筛选培养基于150 mL的锥形瓶中，分别调pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5（分别 设 为 pH值 1、pH 值 2、pH 值 3、pH 值 4、pH 值 5），接入 5% 的扩大培养菌液，34 ℃、150 r/min下培养7 d，5个周期，分别测定OD600 nm的吸光值。研究该菌种的最佳生长pH值。

③P源：准确量取50 mL的筛选培养基于150 mL的锥形瓶中，将培养基的P源分别配制为K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4（ 分 别 设为 P1、P2、P3、P4），在 34 ℃、150 r/min 下培养7 d，5个周期，分别测定OD600 nm的吸光值。研究该菌种的最佳生长磷源。

④N源：准确量取50 mL的筛选培养基于150 mL的锥形瓶中，将培养基的N源分别配制为NaNO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3、KNO3（分别设为N1、N2、N3、N4、N5），接入5%的扩大培养菌液，在 34 ℃、150 r/min 下培养 7 d，5 个周期，分别测定OD600 nm的吸光值。研究该菌种的最佳生长氮源。

⑤盐浓度：准确量取50 mL的筛选培养基于150 mL的锥形瓶中，将NaCl分别按0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（分别设为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5）的量配制培养基，接入5%的扩大培养菌液，在 34 ℃、150 r/min 下培养 7 d，5 个周期，分别测定OD600 nm的吸光值。研究该菌种的最佳盐浓度。

⑥接种量：准确量取50 mL的筛选培养基于150 mL的锥形瓶中，分别按2%、4%、6%、8%、10%（分别设为J1、J2、J3、J4、J5）接入扩大菌液。34 ℃、150 r/min 下培养 7 d，5 个周期，分别测定OD600 nm的吸光值。研究该菌种的最佳接种量。

2）正交实验。

根据单因素实验结果，确定最佳P源N源后，选取温度、pH值、盐浓度和接种量进行正交实验。在最佳条件下设置3组平行实验，培养7 d、5周期后，测量菌株生长量以及COD的降解率。

1.2.5 COD降解率的测定

使用DR1010COD测定仪测定磺化沥青培养基的COD值。使用移液管吸取2 mL样品加入到消解管中，缓慢上下颠倒多次以后用干净的纸巾擦干，并采用等量去离子水设置为对照。将加入了样品的消解管插入预热的DRB200反应器中加热2 h。反应完成后。待温度降低到120 ℃时便可以取出，轻轻晃动待消解管冷却到室温后使用比色法测定COD。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离、鉴定

经过富集、驯化、纯化分离后，得到能以磺化沥青为唯一碳源生长的菌株。形态、生理生化及分子生物学鉴定，结果如图1、图2。

图1 X2的显微结构镜检图

图2 X2菌株系统发育树

由图1可知，该菌为产芽孢的短杆菌。图2结果表明X2与大洋沉积芽孢杆菌相似度最高，暂命名为大洋沉积芽孢杆菌X2。

2.2 降解特性研究

2.2.1 单因素实验

1）温度对X2生物生长量的影响。温度条件处理对X2的生物生长量影响如图3所示，对培养5个周期的菌液进行OD600的吸光度测量。由图3可知，5个周期过程中，菌株生长量呈缓慢增长的趋势。其中W4条件下菌株的生长量最大，确定温度为34 ℃时是最佳培养条件。

图3 不同温度处理对菌株X2生长量的影响

2）pH值对X2生物生长量的影响。pH值条件处理对X2的生物生长量影响如图4所示，对培养5个周期的菌液进行OD600的吸光度测量。由图4可知，5个周期过程中，菌液生长状态起伏较大。其中在第5个周期时pH值为4状态下菌株的生长量最大，确定pH值为8.0时是最佳培养条件。

图4 不同pH值处理对菌株X2生长量的影响

3）P源对X2生物生长量的影响。不同P源条件处理对X2的生物生长量影响如图5所示，对培养5个周期的菌液进行OD600的吸光度测量。由图5可知，5个周期过程中，菌液生长状态起伏较小，但不同P源处理间的差异较大。其中在P2的处理状态下菌株的生长情况处于先上升后平缓的趋势，并且在第2、3、4周期时均大于其他P源处理下的生长量。因此确定P源为KH2PO4时是最佳培养条件。

图5 不同P源处理对菌株X2生长量的影响

4）N源对X2生物生长量的影响。不同N源条件处理对X2的生物生长量影响如图6所示，对培养5个周期的菌液进行OD600的吸光度测量。

图6 不同N源处理对菌株X2生长量的影响

由图6可知，5个生长周期过程中，同种处理不同阶段下的菌液生长量差异较小。但是不同N源处理下的菌液生长量差异较大，其中N4处理状态下菌液生长量最大。因此确定N源为NH4NO3时为最佳培养条件。

5）盐浓度对X2生物生长量的影响。不同NaCl浓度条件处理对X2的生物生长量影响见图7，对培养5个周期的菌液进行OD600的吸光度测量。

图7 不同盐浓度处理对菌株X2生长量的影响

由图7可知，5个周期过程中，5种处理条件下的菌液生长均呈现上升状态。其中Y5处理条件下菌株的生长量最大，确定盐浓度为1%时是最佳培养条件。

6）接种量对X2生物生长量的影响。不同接种量条件处理对X2的生物生长量影响如图8所示，对培养5个周期的菌液进行OD600的吸光度测量。由图8可知，5个周期过程中，5种处理条件下的菌液生长均呈现上升状态。其中J5处理条件下菌株的生长量始终大于其他4个条件处理。确定接种量为10%时是最佳培养条件。

图8 不同接种量处理对菌株X2生长量的影响

2.2.2 正交实验

1）X2生长量正交实验结果如表2。在单因素实验中确定P源为KH2PO4，N源为NH4NO3为最佳条件下，设置不同温度、pH值、盐浓度和接种量进行正交实验。

表2 X2生物量正交实验及其分析表

由表2可以看出，X2菌株在温度为36 ℃、pH值为7.8、盐浓度为1%、接种量为10%时为最佳培养条件。其中pH值的R极差最大，是影响菌株生长的关键因子，其次为盐浓度、温度、接种量。

2）X2的COD降解率正交实验结果如表3。由表3可以得出，COD最佳降解条件：温度为36℃、pH值为8.2、盐浓度为0.9%、接种量为12%，降解率在59%～71%，在34 ℃、pH值为8.2、盐浓度为0.9%、接种量为10%时降解率达到最大值71%。pH值的R极差最大，达到0.068，其次为温度、接种量、盐浓度。

表3 X2的COD降解正交实验及其分析表

3 结果与讨论

获得一株降解磺化沥青的芽孢短杆菌，命名为大洋沉积芽孢杆菌X2。单因素试验结果显示：X2分别在温度为34 ℃、pH值为8.0、P源为KH2PO4、N源为NH4NO3、盐浓度为10%、接种量为10%时为最佳生长环境。正交实验结果确定当温度为36 ℃、pH值为8.2、盐浓度为0.9%、接种量为12%，X2对磺化沥青COD的降解率达59%～71%。pH值的R极差最大，是同时影响菌株生长及COD降解的关键因子，其次为温度、接种量、盐浓度。

利用微生物降解磺化沥青，降解过程中微生物生长情况良好，可以反映出磺化沥青得到了一定的降解。但是在离心过程中容易产生误差，故而建议在后期研究过程中可以选择测量浓度及结构式进一步确定磺化沥青的降解效率。在正交实验过程中，菌体生长的最佳条件与降解的最佳条件不完全相同，因此在降解修复过程需要采取分段式控制其参数，有利于菌体生长与降解COD均在最佳条件下进行。在最佳降解条件下的COD 降解率有待下一步验证试验进一步研究。