山茶籽醇提物对去卵巢AD大鼠学习记忆、脑组织p-tau蛋白的影响

李　海　解继胜　杨　洁　黄月妹　黎　飚

(右江民族医学院组织胚胎学教研室,广西　百色　533000)

脑组织p-tau蛋白增多引起神经纤维缠结、β样淀粉蛋白(Aβ)在脑组织沉积引起大脑中枢的组织损害，在皮下组织Aβ沉积，引起皮肤老年斑，这些病变是阿尔茨海默病(AD)的病理基础〔1～3〕。本文主要探讨山茶籽醇提物对去卵巢AD大鼠学习记忆、脑组织p-tau蛋白的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物选用5月龄SPF级雌性SD大鼠40只，体质量为(350±20)g，为右江民族医学院实验动物中心所提供。大鼠均在(25±2)℃、灯光12 h进行交替，相对的湿度为56%条件规范喂养。随机分为假手术组、模型组、山茶籽组、雌二醇(E2)组各10只。

1.2模型建立30只大鼠用浓度为10 g/L 的戊巴比妥钠水溶液进行腹腔注射(3.0 mg/kg)，检查大鼠麻醉适度后，经腰背部双切口入腹腔，切除卵巢，切口逐层缝合。所切除物均经过组织学切片观察确认。切除卵巢后用硫酸庆大霉素肌注3 d，预防切口感染，并持续3 d。去卵巢1 w后，用浓度为10 g/L的戊巴比妥钠水溶液进行腹腔注射(麻醉剂量为3.0 mg/kg)。将大鼠固定在大鼠专业脑立体定位仪器上，使大鼠前囟暴露于正中切口，把前囟作为原点，向后4.3 mm、旁开2.1 mm为进针点进行颅骨钻孔。从大脑表面缓慢进针达3.1 mm到达双侧海马处，缓慢注入Aβ25～35 1 μl(10 μg，使用微量注射器)，并且留针5 min，确保海马区局部内的组织被注射物浸润充分。造模术后用硫酸庆大霉素肌肉注射避免感染。在颅内注射Aβ25～35结束3 d之后，使用100 mg/kg D-半乳糖并用0.9%生理盐水注射液溶解、稀释至2 ml再进行腹腔注射，1次/d，持续14 d。假手术组：与模型组手术过程相同，只切去卵巢旁边的一小块脂肪，保留卵巢，和AD大鼠模型组同样开颅钻孔用等容量0.9%盐水注射海马局部。

1.3实验动物用药山茶籽组：用山茶籽榨油后的残余物(茶麸)的醇提物进行灌胃，10 ml·kg-1·d-1(5 g生药/g)；E2组：用E2进行皮下注射，按200 μg/kg，2次/w；模型组和假手术组给予等体积的0.9%生理盐水进行灌胃，10 ml/kg，1次/d。

1.4Y型水迷宫实验对各组大鼠8 w实验后的学、记能力测试。在水迷宫水池的中央放置一个水深1.5 cm处的平台，测试各组大鼠空间方位学习及空间方位记忆能力。

1.5免疫组化法检测脑组织p-tau蛋白含量水平①心脏灌注并取脑，用10 g/L浓度的异戊巴比妥钠麻醉大鼠，暴露大鼠心脏，取其左心室血5 ml，并用500 ml 0.9%盐水进行快速灌注。随后断头取脑，左侧脑固定液进行固定脑组织(低温保存用固定10%甲醛溶液)，随后按常规制作切片并染色。右侧大脑匀浆(在低温条件)。②脑组织切片使用免疫组织化学法双重染色，切片置于室温下进行1.5 h干燥,然后用足量PPS液进行反复洗涤，每次洗涤20 min。洗涤后将含0.1%TritonX-100山羊的血清滴注在大鼠脑海马的组织切片上，孵育35～45 min。再次使用抗p-tau的单克隆抗体(1∶400)在4℃的孵化池孵化过夜。次日，在Cy3 标记的二抗(1∶200)湿盒进行孵化2.0～3.5 h。用免疫组化法对大脑组织切片进行染色使用显微镜观察并记录结果。

1.6Western印迹法检测脑组织p-tau蛋白在低温条件下脑组织匀浆并提取p-tau蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。加入45 μg 蛋白样品于凝胶泳道里，电泳使相关目的蛋白带到达胶板的中间点即可断电。电泳后进行聚偏氟乙烯(PVDF)膜转膜，转膜后，在室温下用5%牛奶封闭PVDF 膜2 h，之后加注一抗(p-tau蛋白单克隆兔抗抗体，1∶400；p-tau蛋白抗大鼠的多克隆抗体，1∶10 000)4℃孵化过夜。TBST反复3次洗膜，每次洗膜5 min。注入兔二抗(辣根的过氧化物酶的标记，1∶20 000)室温孵化2 h，用TBST洗膜，5 min/次，连续3次。用电化学发光(ECL)试剂盒发光，凝胶成像分析系统下进行观察，并利用相关灰度检测软件扫描出灰度值。

1.7数据处理应用SPSS15.0软件进行方差分析。

2　结　果

2.1各组造模前后Y型水迷宫实验结果比较见表1。假手术组造模前后到达平台时间和错误率差异均无统计学意义(均P>0.05)；模型组造模后到达平台时间显著长于造模前(P<0.05)，错误率显著高于造模前(P<0.01)；山茶籽组及E2组造模前后到达平台时间差异均无统计学意义(均P>0.05)，造模后错误率均显著降低(均P<0.01)。与假手术组比较，模型组造模后错误率显著升高(P<0.05)；与模型组比较，山茶籽组及E2组造模后错误率显著降低(均P<0.01)；E2组与山茶籽组造模后错误率差异无统计学意义(P>0.05)。

表1　各组大鼠到达平台时间及错误率比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.01

2.2各组p-tau蛋白阳性细胞计数比较与假手术组(9.32±0.52)比较，模型组海马CA1区p-tau蛋白阳性细胞数(75.12±8.73)明显增多(P<0.01)；与模型组比较，山茶籽组(24.31±4.02)及E2组海马CA1区p-tau蛋白阳性细胞数(18.17±2.12)明显减少(均P<0.01)。

2.3各组脑组织p-tau蛋白水平比较见图1。与假手术组(0.12±0.03)比较，模型组海马CA1区p-tau蛋白光密度值(0.27±0.02)明显增大(P<0.01)；与模型组比较，山茶籽组(0.16±0.043)及E2组p-tau蛋白的光密度值(0.15±0.02)明显降低(均P<0.01)；E2组与山茶籽组p-tau蛋白的光密度值差异无统计学意义(P>0.05)。

图1　各组脑组织p-tau蛋白Western印迹电泳图

3　讨　论

神经元骨架的主要成分是微管系统，其与神经细胞多种功能活动密切相关。微管由微管管状蛋白和相关蛋白质构成，tau蛋白在微管相关蛋白中含量最高。正常脑组织中tau蛋白能够促进微管蛋白与微管相关蛋白结合从而聚集成微管； tau蛋白与微管相结合，降低微管的稳定性，导致微管蛋白分解，并诱导微管进一步形成微管束。tau蛋白的等位基因位置在17染色体的长臂上。在正常人群中tau蛋白表达mRNA形式的差异，可剪辑出6种不同的同功异构体。tau蛋白属于磷酸基类蛋白，正常的成熟脑组织中tau蛋白分子中含有2～3个磷酸基团。而在AD患者脑组织中的tau蛋白则表现出过度磷酸化，每分子tau蛋白的磷酸基含量有5～9个，形成多个磷酸基的p-tau蛋白,引起神经纤维缠结及中枢神经病理改变〔4〕，并丧失正常生物功能。

本研究结果证明山茶籽榨油后的茶麸醇提物在对AD大鼠模型治疗效果明显，因为榨油后的山茶籽残余物(茶麸)提取物有E2样作用，通过降低胆碱酯酶的生物活性，避免乙酰胆碱过度水解，增加脑组织胆碱浓度，增强大脑中枢的神经兴奋性和活动能力〔5〕，从而改善AD大鼠模型临床症状；山茶籽榨油后的茶麸乙醇提取物所含的植物性雌激素内含丰富羟基成分，羟基有天然强抗氧化特性〔6〕，从而抑制p-tau蛋白和D-半乳糖在大脑组织堆积和损害，起到防治AD的作用；在脑组织里，雌激素与雌激素受体相结合还有扩张脑组织血管效应，脑组织的血流量增加，也可以使p-tau蛋白在脑组织的沉积减少、损害减轻〔7，8〕；植物性雌激素进入体内促进神经内分泌细胞合成和分泌α-分泌酶，α-分泌酶是水解淀粉蛋白前体酶，有促使淀粉蛋白前体分解和排出作用，减少p-tau蛋白在脑组织的沉积，从而消除或减少AD脑组织病理改变和临床表现〔9〕。综上，榨油后山茶籽的茶麸其乙醇提取物含有植物性雌激素〔10〕，有抗AD作用，特别在防治雌激素缺乏的AD作用更为明显。

1沈悌.21世纪我国老年医学发展方向〔J〕.中国实用内科杂志，2011;31(1)：6-7.

2Lopez-otin C,Blasco MA,Partridge L,etal.The hallmarks of aging〔J〕.Cell,2013;153(6):1194-217.

3Sprott RL.Biomarkers of aging and disease:introduction and definitions〔J〕.Exp Gerontol,2010;45(1):2-4.

4宋锦秋，陈晓春，张静，等.人参皂苷Rb1通过JNK/p38 MAPK途径减轻Aβ25-35 诱导的胎鼠皮层神经元tau蛋白过度磷酸化〔J〕.药学学报，2008；43(1)：29-34.

5赵莘瑜，许予明，常程.美金刚与多奈哌齐治疗中度阿尔茨海默病的对照研究〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2010;45(4)：597-9.

6李海，解继胜，陈建海，等.葛根素对阿尔茨海默病模型大鼠疗效的观察〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2013;48(3)：352-5.

7Merlo S,Sortino MA.Estrogen activates matrix metalloproteinases-2 and-9 to increase beta amyloid degradation〔J〕.Mol Cell Neurosci，2012;49(4):423-9.

8Morinaga A,Ono K,Takasaki J,etal.Effects of sex hormones on Alzheimer′s disease-associated β-amyloid oligomer formation in vitro〔J〕.Exp Neurol，2011;228(2):298-302.

9杨红旗，孙治坤，蒋秋焕，等.雌二醇对大鼠皮质原代神经元α分泌酶活性的影响〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2009;44(5)：999-1003.

10李海，陈建海，王金花，等.山茶籽联合雌二醇对去卵巢大鼠骨组织的影响〔J〕.解剖学杂志，2012;35(3)：286-8,318.