CAR-T细胞制备过程中磁珠法激活T细胞条件的优化

张章，邱顺芳，2，王潇霖，丁乾，王晶，于长明，徐俊杰，张晓鹏

1.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100071；2.安徽大学 健康科学学院，安徽 合肥230000

近年来，随着生物技术的不断发展，肿瘤免疫治疗技术也取得了质的飞跃。尤其随着针对免疫检查点（CTLA-4 抗原和PD-1 抗原）单抗药物[1]的问世，以及特异性靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）修饰的T细胞免疫治疗的崛起[2-3]，免疫治疗技术已得到医学界广泛认同，甚至被认为是肿瘤治疗领域中最有前景的癌症治疗方法。但不管是免疫检查点单抗治疗[4]还是以CAR-T 细胞疗法为“先锋”的过继性免疫治疗，T 细胞都是抗肿瘤免疫过程中的核心执行者[5]。CAR-T 免疫治疗需要对患者自身的T 细胞进行基因工程改造，使其表达可特异性识别肿瘤细胞的CAR[6-9]，并在体外扩增后，回输到病人体内发挥治疗肿瘤的作用。CAR-T 细胞治疗在临床上展现出很好的持久性、肿瘤杀伤能力、靶向性[10-11]及增殖能力[12]，被人们寄予厚望。

在CAR-T 细胞制备过程中，T 细胞的激活和扩增是一个关键步骤，会影响CAR-T 细胞的制备周期和最终CAR-T 细胞的状态。常规的T 细胞激活方式是通过抗CD3 和CD28 的抗体刺激，或将T 细胞与包被anti-CD3/CD28 的磁珠共同孵育。Tumaini 等[13]同时比较了2 种T 细胞激活方法，发现磁珠法可避免中间分离步骤，且产生的总扩增倍数也高于OKT3（抗CD3 的抗体）激活。之前的研究也显示，抗CD3 和CD28 的抗体刺激可以产生适度的T 细胞激活[14]，而磁珠可提供类似天然抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APCs）的作用，激活能力可极大地增强[15-16]。然而，不同的磁珠激活条件可能会影响T 细胞的激活效果，但目前针对其激活条件优化的相关研究报道较少。在本研究中，我们分析比较了3 种T细胞激活条件对激活早期细胞活力、CD3+T 细胞所占比例和T 细胞增殖速度的影响，从而优化T细胞激活条件，以在较短的时间内制备获得CAR-T 细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

青霉素-链霉素（双抗）、胎牛血清（FBS）、白细胞介素2（IL-2）、磷酸缓冲液（PBS）、Gluta⁃MAX-1（100×）、AIM-V CTS、Dynabeads CD3/CD28 CTS均购自Life Technologies公司；Ficoll-Paque PLUS购自GE公司；APC-isotype、APC antihuman CD3购自Biolegend公司；细胞计数板、AO/PI 染料 购自Biolegend公司；Cellometer Auto 2000细胞计数仪和Guava easyCyte流式细胞仪分别为Nexcelom和Millipore公司产品。

1.2 人外周血单个核细胞分离

在知情同意情况下，从健康志愿者体内采集新鲜血液，负压抽取到采血抗凝管中。全血经PBS 等体积稀释后，沿着离心管壁缓慢覆盖在Fi⁃coll-Paque PLUS 上层，用密度梯度离心法分离获得人外周血单个核细胞（human peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），每10 mL 肝素化全血经处理后可得到约1×107PBMCs。经过2 次洗涤细胞，分离后的PBMCs 用含10% FBS、1%青霉素-链霉素、1% Glutamax-1 和100 IU/mL IL-2 的AIM 培养基重悬，于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养，2～3 d 后更换新鲜培养基。所有PBMCs 或直接用于实验；或重悬于含90% FBS 和10%DMSO 的冻存液中，于-80℃冻存。

1.3 T细胞激活

T 细胞激活采用结合有抗CD3 和抗CD28 抗体的磁珠实现。细胞计数后，1200 r/min 离心5 min 收集获得PBMCs，再将PBMCs 与磁珠数按一定的比例混合（两者的比例分别为1∶3、1∶1、3∶1），用5% FBS 重悬细胞至终浓度为1×108/mL，在22℃室温下，以3 r/min 的速度放于垂直混合仪上充分混匀约30 min，孵育完成后的T 细胞再次计数，并以5×105～10×105/mL 的密度用AIM 完全培养基培养。

1.4 T细胞计数

用细胞计数仪检测不同激活条件下的T 细胞活力及活细胞数。取出15 μL 吹吸混匀的细胞悬液，与相同体积的AO/PI 染料混匀，向计数板的加样孔中加入约20 μL 两者混合液，在“immuno cell，low RBC”模式下，获得活细胞密度及直径等相关信息。按照下式分别计算活细胞总数和T 细胞活力：

图1 不同激活条件下PBMCs 的活力及细胞直径分布

1.5 流式细胞术检测CD3+T细胞比例

用流式细胞仪检测CD3+T 细胞比例。分别在T 细胞激活前后收集细胞，置于流式管中，洗涤3 次后用100 μL PBS 重悬细胞，分别向管中加入APC 标记的anti-human CD3 抗体及Isotype 对照抗体，4℃避光染色30 min，再次将细胞清洗3 次以除去游离染料，用300 μL PBS 重悬细胞，用Gua⁃va 流式仪检测，用相关软件分析得到的数据。

2 结果

2.1 激活条件对细胞活力的影响

将细胞与磁珠于22℃共孵育30 min，使得两者充分接触。3 种激活条件下的细胞用AO/PI 染色，细胞计数仪分析结果如图1A。孵育30 min后，随着磁珠数的增加，细胞活力呈递减趋势。当PBMCs 数与磁珠数比例为3∶1 时，细胞活力约为70%；当PBMCs 数与磁珠数比例为1∶1 时，细胞活力为60%左右；而当PBMCs 数与磁珠数比例为1∶3 时，活力仅为55%左右。

同时，我们也检测了不同激活条件下细胞的直径。细胞直径是表征细胞大小及状态的重要参数。经过短暂的激活后，不同激活条件下的活细胞主要直径范围稍有差别（图1B）。激活前，活细胞主要直径范围为7.7～9.7 μm，此范围细胞占细胞总数的80%以上；PBMCs 数与磁珠数比例为3∶1 时，活细胞主要直径范围为9.7～10.7 μm，范围内细胞占细胞总数的50%左右；PBMCs 数与磁珠数比例为1∶1 时，主要直径范围为8.7～9.7 μm，占细胞总数的33%左右；而PBMCs 数与磁珠数比例为1∶3 时，主要直径范围为7.7～8.7 μm，目标细胞数占细胞总数的25.7%左右。然而，4 种情况下，死细胞直径范围基本一致。以上结果表明，经磁珠短暂孵育激活，对PBMCs 的细胞活力会有较大影响。

图2 不同激活条件下的淋巴细胞群分离

2.2 磁珠比例对激活早期CD3+T细胞的影响

PBMCs 中的T 细胞是CAR-T 细胞治疗的核心执行者，因此我们接下来着重分析了3 种激活条件对CD3+T 细胞的影响。如上所述，细胞与磁珠按一定比例混匀孵育后，分别进行抗CD3 抗体标记，并用流式细胞仪检测。首先通过FSC/SSC（前向散射光/侧向散射光）分离淋巴细胞群，结果如图2。激活前的淋巴细胞占总细胞的24.2%；而激活后，淋巴细胞群的比例随着用于T 细胞激活的磁珠数目不同而有所变化。当PBMCs 与磁珠比例为3∶1 时，淋巴细胞总数占PBMCs 总数的29.6%；当PBMCs 与磁珠比例为1∶1 时，淋巴细胞数占14.2%；而当PBMCs 与磁珠比例为1∶3 时，淋巴细胞数仅占6.05%。

随后，进一步检测了3 种激活条件下CD3+T细胞占淋巴细胞的比例，结果如图3。相对于同型对照而言，激活前的CD3+T 细胞占淋巴细胞总数的64.5%；而随着用于T 细胞激活的磁珠增加，激活后CD3+T 细胞的比例也呈递减趋势。当PBMCs 数与磁珠数比例为3∶1 时，CD3+T 细胞占淋巴细胞总数的60%左右；当PBMCs 数与磁珠数比例为1∶1 时，CD3+T 细胞占淋巴细胞总数的34.1%；而当PBMCs 数与磁珠数比例为1∶3 时，CD3+T 细胞却只占淋巴细胞总数的28.1%左右。这一结果表明，用于T 细胞激活的anti-CD3/CD28磁珠数目过多，会导致CD3+T 细胞死亡，而这也是导致PBMCs 整体活力降低的主要原因。

2.3 T细胞激活对增殖的影响

好的激活条件应当能有效促进T 细胞增殖，而这会影响整个CAR-T 细胞制备的周期。基于此，我们检测了不同激活条件对细胞增殖速度的影响。PBMCs 与磁珠孵育30 min 后，3 种激活条件处理的细胞连续培养15 d。通过在不同培养时间下统计细胞数（孵育30 min 后计数得到的细胞总数作为第0 d 细胞），发现3 种激活条件下的T 细胞生长趋势大体一致（图4）。在激活后培养的初期（0～3 d），3 种激活条件下的细胞总数基本无变化，细胞总体处于生长缓慢的适应期；培养一段时间后进入快速生长期。其中，以PBMCs 数与磁珠数比例为1∶1 时细胞增殖最为明显，连续检测至15 d，细胞仍处于快速生长期，而且在第15 d 时细胞数已扩增约50 倍；而其他2 种条件下的T 细胞，在培养8 d 之内细胞数都没有明显增长，培养至15 d 时细胞总数扩增了仅约15 倍。实验结果表明，PBMCs 数与磁珠数比例为1∶1 进行T 细胞激活时，更利于T 细胞的扩增。

图3 不同激活条件下CD3+ T 细胞所占比例

图4 不同激活条件下T 细胞生长曲线

3 讨论

CAR-T 细胞的制备过程包括PBMCs 分离、激活及外源基因导入等步骤，其中T 细胞的激活是细胞增殖及CAR-T 细胞制备的基础。天然T 细胞的活化、增殖和分化需要2 种信号：第一种是T细胞表面受体（TCR）同抗原呈递细胞上的MHC/抗原复合物的特异性相互作用，此信号是必需的，但不能充分激活细胞；第二种是共刺激信号，通过T 细胞表面的共刺激受体（如CD28、4-1BB、OX-40）与靶细胞或抗原呈递细胞表面相应配体（如B7、4-1BBL、OX-40L）的结合。这一信号对于IL-2/IL-2R 的诱导表达及T 细胞增殖分化为成熟的效应T 细胞而言，都是至关重要的[17]。而从血液中分离获得的人外周血淋巴细胞，与包被抗CD3 和CD28 抗体的磁珠结合后，可同时为T 细胞提供激活和扩增所需的初始及共刺激信号。已有研究表明，这种方式可以有效地在体外激活T细胞。目前各种研究中多将3 倍PBMCs 数量的磁珠直接加入T 细胞培养基中[18-19]。

本研究采用PBMCs 与磁珠在高密度条件下于22℃孵育30 min 的方式对T 细胞进行激活，PBMCs 与磁珠的比例分别为3∶1、1∶1 和1∶3。研究结果显示，磁珠比例增加，会导致CD3+T 细胞大量死亡。其原因可能是过多的磁珠导致重复的T 细胞激活，从 而诱导Fas 和FasL 以及FLIP 的表达，最终引起激活诱导的细胞死亡。此外，营养限制、有毒废物累积或细胞临界培养密度限制等也是影响细胞活力的潜在因素[20]。而且，过多的磁珠激活会影响用于进一步培养的T 细胞数量。根据本研究的数据估算，从健康志愿者体内获得10 mL 新鲜血液（大约能分离获得1×107PBMCs），采用PBMCs 与磁珠比例为1∶3 的条件激活细胞时，激活30 min 后最终可用于进一步培养的CD3+T 淋巴细胞数只有1.7×105左右；而当PBMCs 数与磁珠数比例为1∶1 时，得到的T 淋巴细胞数可达4.85×105左右。更重要的是，激活条件还会影响T 细胞的增殖速度。当PBMCs 数与磁珠数比例为1∶1 时，T 细胞扩增速度是其他2 种条件下的3 倍。这可能与当磁珠数用量过多时，导致其他单核细胞的丢失有关。因为研究表明未分离的淋巴细胞比纯化的T 细胞单独培养更有优势，大量存在的单核细胞会通过结合T 细胞表面分子和释放细胞因子（通过旁分泌和自分泌的方式）来共激活T 细胞[21-22]，从而促进T 细胞增殖、细胞因子分泌等功能。

值得注意的是，1∶3的PBMCs与磁珠比是CAR-T 细胞相关研究常用比例[23-25]。但本研究结果显示，在这一激活条件下，整体细胞活力和CD3+T 细胞比例都是最弱的，T 细胞增殖速度也并不突出。而当PBMCs 与磁珠比为3∶1 时，细胞活力和CD3+T 细胞比例方面最好，但这是以T 细胞的不能充分激活为代价的，这一条件下需要更长的时间使T 细胞进入快速增长期。PBMCs 与磁珠比为1∶1 时磁珠激活T 细胞的效果更好，所以即使起始扩增的T 细胞数相对于3∶1 时较少，T 细胞的增长速度仍最快。而1∶3 可能会导致过多的磁珠刺激，引发T 细胞死亡和单核细胞丢失。这说明1∶3 并不是T 细胞激活的最适条件。

综上所述，我们用包被抗CD3 和CD28 抗体的磁珠激活T 细胞，通过比较3 种激活条件，发现PBMCs 与磁珠比例在早期即对细胞活力、CD3+T细胞比例以及细胞增殖速率有较大影响，并提供了一个相对于现行方法更佳的PBMCs 与磁珠比例。当PBMCs 数与磁珠数比例为1∶1 时，有利于T 细胞的快速扩增，这对于在较短时间内获得足够的T 细胞，缩短整个CAR-T 细胞制备周期具有较重要的意义。