靶向兔肌肉生长抑制素基因CRISPR/Cas9载体的构建和活性分析

尤　双， 曹　洋， 李村院， 魏军昌， 李晓悦， 张翔宇， 姚　洋， 胡圣伟， 倪　伟

(石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832000)

基因编辑技术已经发展成为研究基因功能的工具，在生物医学研究和农业上改善动物特性，从而产生基因修饰动物模型。CRISPR/Cas9系统包括1个单链导向RNA(sgRNA)和1个人类的优化密码子Cas9核酸酶，通过非同源末端连接(简称NHEJ)能够诱导靶突变。

家兔在生物分子研究中是一个很有发展前景的动物模型，它们与人类在生理学和解剖学等方面比小鼠和大鼠更相似，而且与猪和猴[1]相比，饲养费用低、妊娠时间短[2]。因此，选择用基因敲除的兔作为疾病动物模型，为探索和研究人类疾病机制、治疗性药物筛选提供了重要研究工具。现有研究显示，基因敲除家兔是研究肥厚型心肌病、脂类代谢和动脉粥样硬化的极佳模型[3-6]。Myostatin(简称MSTN)又称GDF-8，属于转化生长因子超级族(transforming growth factor bata，简称TGF-β)。它用于反向调节肌肉生长[7-8]。已经有报道表明，MSTN的自然突变在牛、绵羊[9-10]身上造成肌肉的过度生长。增加肌肉组织的双肌表型特征在MSTN 敲除绵羊、猪和狗[11-13]身上也已经获得，从而鼓励我们研究MSTN敲除兔，用于研究肌肉的发展，以便将来在农业上提升动物特性。

目前，细胞转染外源基因最常用的高效方法有脂质体介导转染、病毒介导转染和电穿孔法。电穿孔是外加电场造成细胞质膜暂时性结构改变形成可恢复空隙时，将外源基因转移到细胞的过程，此方法操作具有简单、快捷、可重复性强、适应性广等优点[14]。

本试验通过使用 Lonza Nucleofector 设备，对家兔的成纤维细胞进行电转，验证了CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑的高效性，为后续获得MSTN敲除兔打下基础。

1　材料和方法

1.1　主要试剂及仪器

Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa)，质粒小提试剂盒(离心柱型)(TIANGEN)，琼脂糖凝胶回收试剂盒(普通离心柱型)(TIANGEN)，BbsⅠ(NEB)，DL10000 DNA marker、DL2000 DNA marker[宝生物工程(大连)有限公司]，感受态菌DH5α(实验室自制)，引物合成和测序由Invitrogen公司完成。青霉素-链霉素溶液，DMEM高糖培养液(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，P3 Primary cell 4D-Nucleofector×Kit L(24RCT)(Lonza 公司，德国)，无内毒素质粒大抽提取试剂盒(TIANGEN)；Lonza 4D-Nucleofector 电转仪(Lonza 公司，德国)，冰箱(海尔集团，中国)，移液器(Eppendorf 公司，德国)，CO2恒温培养箱(Sanyo 公司，日本)，超净工作台(Baker 公司，中国)，冻存盒(Nalgene，美国)，0.22μm 微孔滤膜(Millipore 公司，美国)，倒置相差显微镜(Nikon，德国)。

1.2　方法

1.2.1sgRNA设计和合成根据GenBank中公布的兔MSTN基因序列(序列号：AM931157.1)，利用CRISPR/Cas9在线设计工具(http：//tools.genomeenging.org)设计sgRNA。选择DNA的正义链或反义链的序列GGN18NGG或GGN17NGG作为靶位点。引物见表1，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行化学合成。

1.2.2Cas9/gRNA表达载体的构建将sgRNA上下游引物配制为100 μmol/L浓度，各取10 μL混合，于95 ℃水浴 5 min 后，关闭水浴锅，在水浴中自然缓慢降温至室温退火。用限制性内切酶BbsⅠ(NEB)切割PX330载体，使其线性化。用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒

表1　PCR反应引物

(TIANGEN)回收CRISPR/Cas9线性化载体。线性化载体与退火的sgRNA用T4连接酶于16 ℃连接过夜，转化至DH5α感受态菌中，2 d后挑取单克隆，保菌并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3兔成纤维细胞的分离及培养选择怀孕约15～20 d的新西兰母兔处死，取出子宫，放在培养皿中。无菌条件下取出胎儿，剪去头、尾、四肢并去除内脏，在超净台上，用含 100 mg/L 青霉素和 100 mg/L链霉素的无菌磷酸缓冲盐溶液(简称PBS)将上述预处理的部分组织漂洗 3～5遍，在无菌培养皿中用眼科剪剪切成约1 mm3的小块，采用组织块培养法，获得原代成纤维细胞。然后进行常规的原代和传代培养，或冷冻保存或用于转染。

兔成纤维细胞培养采用DMEM培养液(含15%胎牛血清)，37 ℃、5.0% CO2饱和湿度培养。当细胞生长至汇合度为90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心 8 min。洗涤收集细胞，用于电转染和细胞基因组检测。

1.2.4电转染按照Lonza Nucleofector电转仪操作说明，82 μL S1溶液和18 μL S2溶液。收集1.0×106个细胞，加入5 μg除内毒素的Cas9/gRNA质粒，用100 μL电转液混合悬浮细胞，混匀后转入电转杯中。选择小鼠胚胎成纤维细胞程序EH-100，对兔胚胎成纤维细胞实施电转。电转结束后静置10 min，将电转细胞转入提前温育的20% FBS培养液的6孔板中，37 ℃，5.0% CO2饱和湿度培养，5～6 h后换液。转染24 h后，转放于30 ℃、5.0% CO2饱和湿度培养，48 h后，再于37 ℃培养。待细胞长满，收集细胞，提取细胞基因组。

2　结果与分析

2.1　sgRNA设计

利用CRISPR/Cas9在线设计工具(http：//tools.genomeenging.org)，针对家兔MSTN基因的CDs区设计了sgRNA(图1)。MSTN基因外显子3为生物活性区。为了失活MSTN外显子3，选择靶位点位于MSTN基因第二外显子区的sgRNA用于后续研究。

2.2　Cas9/gRNA表达载体的构建和鉴定

通过质粒小提试剂盒，提取PX330质粒。BbsⅠ酶切后，由图2可知，酶切后的PX330为单一条带，而对照质粒为2条条带，表明酶切成功。切胶回收后与gDNA按一定比例，16 ℃ 水浴过夜连接。将连接产物通过热激转化法导入感受态菌DH5α，小量扩增。2 d后挑单克隆菌落，过夜摇菌扩增，保菌并送测序。测序结果表明，sgRNA成功连入PX330质粒(图3)，Cas9/gRNA表达质粒pCas9/gRNA构建成功。

2.3　EGFP表达及转染效率

由于CRISPR/Cas质粒没有荧光表达信号，于是将EGFP质粒与pCas9/gRNA质粒共5 μg转染家兔成纤维细胞，共转染的细胞表达荧光，表明电转染质粒表达成功。核转染24 h后，可见绿色荧光表达，细胞生长迅速，活力良好(图4)。

2.4　Cas9/gRNA敲除效率

核转染3d后，观察细胞生长至80%～90%时，收集细胞，提取细胞总DNA，通过PCR扩增出目的条带，连接pMD19-T载体，随机挑取13个单克隆进行测序。由图5可知，3个克隆中的MSTN基因发生了突变，其中2个克隆出现了相同类型的碱基缺失(CA碱基缺失)，另一个出现了单碱基突变(A突变为G)。经计算pCas9/gRNA载体的基因突变效率为23%。

3　讨论

CRISPR/Cas9系统是发展最为迅猛的基因编辑技术，它不仅效率高、适应面广，且操作简单、周期相对较短。越来越多地取代ES打靶技术基因组特定位点的修饰，这让基因编辑技术的广泛应用和普及成为可能。近年来，相当多的报道提到应用CRISPR/Cas9方法在不同物种中实现了基因敲除、插入和突变。

原则上，所有个体都可作为组织细胞的供体，但同样细胞来自幼年个体比来自老年个体的易于培养；来自同一个体的组织，分化程度低的组织细胞比分化程度高的容易培养。因此，在试验取材时，本试验选用了 15～20 日龄的家兔胚胎作为成纤维细胞的供体。

电转染对细胞的生长状态要求比较严格，细胞传代最好在 6 代以内且生长状态良好，细胞密度达到 70%～80%融合时最适宜做电转染[15]，细胞密度太高，影响细胞的生长，会导致转染效率的降低。因此，在进行细胞转染时，选用的是第三代细胞，并且细胞密度达到约80%开始进行试验。

本试验通过使用 Lonza Nucleofector 设备，对家兔的成纤维细胞进行电转，将EGFP质粒与pCas9/gRNA质粒共转染家兔成纤维细胞，从而验证笔者构建的pCas9/gRNA质粒在细胞水平上对MSTN的敲除效率，笔者初步验证Cas9/gRNA的敲除效率约为23%，为下一步进行胚胎显微注射和体细胞克隆技术制备MSTN基因敲除家兔奠定基础。

在本试验中，构建的重组质粒对家兔成纤维细胞进行转染时，因使用的核转染仪中没有专门针对转染家兔的成纤维细胞设定的程序，所以选用绵羊成纤维细胞转染程序进行转染，可能对试验结果有一定的影响。

参考文献：

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