洛龙党参与其他川党参遗传多样性的ISSR分析

杨正久， 代建忠， 梁大敏， 毛朝坤， 董红梅， 马增凤

(1.遵义医药高等专科学校医学技术系，贵州遵义 563006； 2.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005)

党参为桔梗科党参属植物，川党参产于四川、贵州、湖南、湖北、陕西等省，历史悠久，品种较多，已大量人工栽种，不同品种间的性状与药用成分含量存在差异。洛龙党参又名洛党，产于贵州省道真仡佬族苗族自治县东北部的洛龙山区而得名，是川党参的生态变种[1]，以其肉质鲜嫩、药用价值高而深受外界青睐。党参主要成分有多糖、党参苷、甾醇类、生物碱、内酯类、豆素类等，具有益气生津、补脾养胃的功效，用于脾肺虚弱、气短心悸、虚喘咳嗽、内热消渴等病症[2]。余兰等研究表明，洛龙党参的多糖含量达25.6%～27.75%，比其他川党参高10.97%[3]。

目前分子标记用于党参种质遗传多样性的研究较少，利用简单重复序列区间(ISSR)分子标记技术对道真洛龙党参种质资源遗传多样性方面的研究还尚未见报道。本研究利用ISSR技术对道真阳溪和坝羊的洛龙党参与四川、重庆等地其他川党参的种质遗传多样性进行研究，为贵州省遵义市种植党参品种的鉴定、筛选利用及遗传改良提供方法和理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料及来源

本研究共采用12个党参品种(表1)，分别来自贵州省遵义道真县、重庆、湖北及四川种植党参种子萌发的嫩叶。选取成熟种子，脱粒去杂，催芽后，置于放有滤纸的培养皿上于 25 ℃ 萌发，发芽3～5 cm高时取幼苗嫩叶，置于-40 ℃冰箱保存备用。

1.2　仪器与试剂

主要仪器：GelDoc XR+凝胶成像系统(BIO-RAD)，Eppendorf Mastercycler®普通PCR仪，Smart SpecTM3000型分光光度计(BIO-RAD)，VE-180型电泳槽(上海天能科技有限公司)，EPS-300型电泳仪(上海天能科技有限公司)，TGL-16G 台式离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)。主要试剂：丙烯酰胺、双丙烯酰胺、硝酸银、37%甲醛、四乙基乙二胺(TEMED)、ISSR引物(北京赛百盛基因技术有限公司)。

表1　试验材料及来源

1.3　党参基因组DNA的提取

取党参试验材料，采用经改进的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取DNA[4-5]，用琼脂糖凝胶电泳测定其纯度，用分光光度计测定其浓度，将提取的DNA稀释到终浓度 40 ng/μL，用作PCR扩增的模板。

1.4　ISSR引物的筛选和PCR扩增

选用提取的党参基因组DNA为模板，进行ISSR引物筛选和PCR反应扩增。PCR反应体系为20 μL：模板DNA 1 μL(约30～53 ng)，ISSR引物1 μL(约5 pmol)，PCR mix 18 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取扩增产物5 μL 在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，以0.5×TBE为缓冲液，稳压150 V，电泳至溴酚蓝距凝胶边缘2～3 cm处结束。采用银染法进行染色。

1.5　数据处理与分析

ISSR-PCR扩增产物经电泳检测后，得到电泳图谱，用Quantity One 6. 0分析软件结合人工读带，按条带的有无(有记为1，没有则记为0)记录电泳条带，同时将出现频率超过99%的条带视为共有带，出现频率低于1%的条带，即被视为没有条带而不计入内。将读出的数据录入Excel，建立数据库矩阵。

应用NTsys 2.10e软件，利用ISSR分子标记数据计算党参品种间的遗传相似性系数，采用非加权组平均法(UPGMA)构建党参品种间的遗传关系聚类图；将SM遗传相似性矩阵进行Dcenter数据转化，求其特征量和特征向量，生成主坐标二维、三维散点图。

2　结果与分析

2.1　ISSR引物的筛选及扩增结果

以来自道真阳溪1号和2号党参基因组DNA作为模板，从100条引物中筛选出10条引物。利用这10条引物能在12个党参试验材料中扩增出清晰的条带，且多态性、稳定性和重复性较好(表2)。

表2　引物筛选及扩增结果

2.2　ISSR-PCR图谱及多态性分析

本研究从100条引物中筛选出扩增条带清晰、重复性好、多态性丰富的10条引物，对12份供试党参样品进行ISSR-PCR扩增，共扩增出136个可区分的DNA条带，平均每条引物扩增出13.6条条带(表2)。在扩增出的136条DNA条带中，多态性条带有114条，多态性条带占比为83.82%，平均每条引物扩增11.4条多态性条带。其中引物UBC807和UBC811扩增的条带数及多态性条带数较为丰富(图1)，DNA总条带数分别为16条和19条，多态性条带数分别为14条和16条。这表明川党参种质具有较为丰富的遗传多样性。

2.3　遗传相似性分析

利用ISSR分子标记数据计算党参品种间的遗传相似性系数(表3)。ISSR-PCR扩增结果表明，12个党参品种之间的遗传相似性系数均在0.5以上，平均为0.683 6，处于 0.518～0.908之间。其中道真阳溪洛龙党参品种(1)和四川乐山党参品种(12)之间的遗传相似性系数最小，为0.518，二者之间亲缘关系最远；四川乐山(12)和四川雅安(10)之间的遗传相似性系数最大，表明二者之间的亲缘关系最近。道真县的3个洛龙党参品种(1、2、3)之间的遗传相似性系数均较大，在0.775以上，但道真洛龙党参品种与四川地区的6个品种(7～12)之间的遗传相似性系数较小，在0.50～0.65之间，表明遵义道真洛龙党参品种与四川地区党参品种的亲缘关系较远。

表3　遗传相似性分析结果

2.4　聚类分析

基于遗传图距，应用NTsys 2.10e软件，对来自道真洛龙、四川、重庆及湖北的12个党参品种进行UPGMA聚类分析。如图2所示，12个党参品种在0.591处分为A、B 2支，来自遵义道真、重庆及湖北的6个党参品种(1～6)聚为A支，来自四川省的6个党参品种(7～12)聚为B支，而A支中来自道真洛龙和重庆奉节与巫山的党参品种又聚为A1支，A1支又分为A11(道真3个品种)和A12(重庆2个品种)2支，来自湖北的党参品种(6)单独成1支(A2支)，来自四川的6个党参品种分为B1和B22支，但遗传差距很小。结果表明，本研究中的12个党参种植品种与地理分布有着明显的相关性，来自同一地区的品种间遗传差异较小，而不同地区的品种之间的遗传差异最大。

2.5　主坐标分析

主坐标分析以党参品种间的遗传相似性系数矩阵为基础，不同品种在主坐标图中的位置能反映它们之间的亲缘关系。品种间位置越接近，表明它们的遗传相似性越大，亲缘关系越近，反之，则表明遗传差异越大，亲缘关系越远[6]。产生的主坐标二维、三维散点图分别见图3、图4。不难看出，主坐标分析结果与聚类分析结果一致。来自道真洛龙的3个党参品种(1～3)遗传相似性较高，聚集在二维图的右上角，来自重庆及湖北的3个党参品种分布在二维图的右下方；来自四川的6个党参品种(7～12)遗传距离较远，分布在二维图的左侧，由于四川的6个党参品种间的遗传差异很小，因此密集地聚集在一起。从三维图上更能看出品种间的分类很明显。

3　结论与讨论

DNA分子标记技术发展至今已有几十种，ISSR分子标记技术由于具有成本低、可靠性及稳定性高，试验操作简单、快速、高效等优点，被广泛应用到各类研究中，是理想的分子标记技术[7-8]。利用ISSR分子标记技术研究党参遗传多样性的报道不多，陈大霞等用21条ISSR引物对18份川党参材料扩增出223个DNA条带，其中有166个多态性条带，平均多态率为74.44%[9]；郭宏波从100条ISSR中筛选出13条引物，对来自山西和甘肃2省的150份党参材料进行分析，扩增出127个清晰的DNA条带，其中多态性条带122个，平均多态率为95.77%[10]。以上研究表明，ISSR分子标记技术具有良好的稳定性和准确性，适合用于种质资源遗传多样性的分析。

本研究选用洛龙党参和四川、重庆、湖南各产地种植党参品种，以党参的幼苗为材料，对CTAB法进行优化改良，提取党参基因组DNA。通过优化PCR反应体系，从100条不列颠哥伦比亚大学(UBC)公布的ISSR引物中筛选，以不同产地种植党参的基因组DNA为模板，用筛选的ISSR引物进行分子标记PCR扩增，用聚丙烯酰胺电泳对产物进行检测，有利于扩增产物的分辨。本次筛选出的10条ISSR引物对12个党参品种共扩增出136个清晰的DNA条带，多态性条带114条，平均多态性比例为83.82%，最高为92.86%，最低为71.43%。其中引物UBC811扩增出的DNA条带总数和多态性DNA条带数最多，分别为19条和16条；而引物UBC835扩增的DNA条带数最少，只有8条，多态性DNA条带数6条。ISSR标记DNA图谱表明，洛龙党参与其他川党参具有丰富的基因资源。基因型是遗传和生态2个因素长期复杂的相互作用的产物，土壤和地理环境对种内变异起重要作用[11]。党参大面积的种植通常采用种子和种根2种繁殖方式[9]，零星种植也常采用野生种及半野生种的驯化栽培，因此党参种源复杂，加上道真、四川、重庆及湖北等地不同土壤和地理环境以及气候与光照的影响，造成了党参品种具有丰富的遗传多样性。

遗传相似性分析与基于遗传距离的聚类分析及主坐标分析显示，12个党参品种遗传距离与地理位置分布有着明显的相关性。四川省的6个党参品种遗传距离较远，形成1支，且品种间的遗传距离很近，相似性高；道真洛龙党参与重庆党参品种遗传相似性最高，与湖北党参品种间的遗传相似性次之，与四川省的党参品种遗传相似性最低。张建清等利用随机扩增多态性DNA标记(RAPD)技术分析甘肃栽培党参的遗传多样性时，也发现党参栽培居群的遗传距离与地理分布呈现一定的相关性[12]，这可能与地域间基因的流动受限有关，也与大面积党参种植采用种根繁殖有关， 影响了党参种质的遗传多样性。因此，建议在今后的党参育种过程中，考虑开展不同优良品种中种群间的杂交育种，以获得更广泛的遗传基础，培育出优良的新品种。

参考文献：

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[3]余兰，陈华，娄方明，等. 洛龙党参的多糖含量测定[J]. 贵州农业科学，2010，38(7)：190-191.

[4]周东新，祁建民，吴为人，等. 黄麻DNA提取与RAPD反应体系的建立[J]. 福建农业大学学报，2001(3)：334-339.

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[6]何峰，唐灿，王子雯，等. 巴中栀子遗传多样性的ISSR分析[J]. 中国医院药学杂志，2014，10(34)：782-786.

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[8]Gilbert J E，Levis R V，Wilkinson M J. Developing an appiopriate strategy to assess genetic variability in plant germplasm collections[J]. Theoretical and Applied Genetics，1999，98(6/7)：1125-1131.

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[10]郭宏波. 野生与栽培党参遗传多样性及其保存和保护策略研究[D]. 上海：复旦大学，2007.

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[12]张建清，苏雪，吴琼，等. 药用植物党参的RAPD分析[J]. 中药材，2006，29(5)：417-420.