鸡内源性抗菌肽LEAP-2的生物信息学分析

杭柏林， 徐　军， 胡建和

(河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003)

抗菌肽(antimicrobial peptides，简称AMPs)是生物机体内具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性的多肽，是机体先天免疫系统的重要组成部分[1-2]。抗菌肽具有低毒、高效、抗菌谱广、低耐药等特点，成为抗生素替代物研究中的佼佼者[3-4]。Krause等从人血液中分离到肝脏表达的抗菌肽LEAP-1、2，其中Ⅱ型肝脏表达抗菌肽(liver-expressed antimicrobial peptide 2，简称LEAP-2)有较强的抗微生物活性，但肽的序列、二级结构和表达等方面与其他已知肽类有差异[5]。从鸡体内分离到的LEAP-2由76个氨基酸构成，具有抗微生物(如沙门氏菌)的活性[6]。但鸡LEAP-2(cLEAP-2)的许多生物信息学内容还不是很清楚。因此，本研究基于cLEAP-2的氨基酸序列利用在线生物软件和程序进行生物信息学分析，为深入探讨其抗菌作用机制提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料

鸡内源性抗菌肽LEAP-2的氨基酸来自网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/，登录号为NP_001001606，其序列为MHCLKIMAFLLFFSLLLSQVYCASLHQPQPLLRLKRMT PFWRGVSLRPVGASCRDNSECITMLCRKNRCFLRTASE。

1.2　方法

1.2.1抗菌肽理化性质分析利用www.expasy.org/tools网站中的ProtParam工具对抗菌肽cLEAP-2进行理化性质参数的分析。

1.2.2抗菌肽的二级结构预测利用https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html网站的二级结构预测工具进行抗菌肽cLEAP-2的二级结构预测。

1.2.3抗菌肽的跨膜区分析利用http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html网站的TMpred网站的工具进行抗菌肽cLEAP-2的跨膜区分析。

1.2.4抗菌肽的信号肽预测利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP网站的Signal4.1Server工具分析抗菌肽cLEAP-2的信号肽。

1.2.5抗菌肽细胞内定位的预测利用http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/eu_predict.htm网站的亚细胞定位分析工具Sublocal v1.0进行抗菌肽cLEAP-2的细胞内定位预测。

1.2.6抗菌肽糖基化和磷酸化位点预测利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/网站的NetOGlyc 4.0 Server工具和http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/网站的NetPhos3.1Server工具分析抗菌肽cLEAP-2的糖基化和磷酸化位点。

1.2.7抗菌肽的三维空间结构分析利用http：//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1网站的工具进行抗菌肽cLEAP-2三级结构的预测。

1.2.8抗菌肽保守结构域的预测利用http：//smart.embl-heidelberg.de/网站中的工具进行抗菌肽cLEAP-2保守结构域的预测。

1.2.9抗菌肽的抗原表位分析利用DNAStar软件中的Protean工具进行抗菌肽cLEAP-2的抗原表位分析。

1.2.10抗菌肽的氨基酸序列进化分析在GenBank中检索到鸡和其他42个物种的LEAP-2的氨基酸序列。利用DNAstar软件中的MegAlign工具，采用Jotun Hein算法进行抗菌肽cLEAP-2的氨基酸序列进化分析。

2　结果与分析

2.1　抗菌肽cLEAP-2的理化性质

鸡内源性抗菌肽cLEAP-2分子式为C392H635N113O99S10，有76个氨基酸残基，由20种基本氨基酸组成，所含的氨基酸残基数量和含量见表1。cLEAP-2的分子量为 8 835.65 u，等电点为9.86，带负电的残基(Asp+Glu)数为3个，带正电荷的残基(Arg+Lys)数为11个。在体外，cLEAP-2 的半衰期在哺乳动物细胞中为30 h，在酵母中>20 h，在大肠杆菌中>10 h。经软件计算，不稳定指数为57.27，表明cLEAP-2为不稳定蛋白。总GRAVY值为0.205，表明cLEAP-2为疏水蛋白。

表1　cLEAP-2的氨基酸组成

2.2　抗菌肽cLEAP-2的二级结构

经软件分析(参数：window width为17，similarity threshold为8，number of states为4)，cLEAP-2的二级结构(图1)中，α螺旋(36个氨基酸残基参与)占47.31%，延伸链(9个氨基酸残基参与)占11.84%，β转角(6个氨基酸残基参与)占7.89%，无规则卷曲(25个氨基酸残基参与)占32.89%。

2.3　抗菌肽cLEAP-2的跨膜区预测

经软件分析(参数：跨膜螺旋长度为17～33aa，得分>500)，cLEAP-2存在跨膜区(图2)。从里(inside，简称i)到外(outside，简称o)，可能存在于第6～23位氨基酸残基之间(得分为2 090)；从外到里，可能存在于第3～21位氨基酸残基之间(得分为1 748)。

2.4　抗菌肽cLEAP-2的信号肽预测

经软件分析(Cutoff为0.45)，cLEAP-2存在信号肽(图3)，位于第1～22位氨基酸残基之间，得分为0.937。信号肽与成熟肽的剪切位点在第22位和第23位氨基酸残基之间。

2.5　抗菌肽cLEAP-2的细胞内定位

经软件分析，cLEAP-2主要定位于细胞核内[可信度指数(reliability index)=4，预期准确率(expected accurcy=91%)]。

2.6　抗菌肽cLEAP-2的糖基化和磷酸化位点

经软件分析，cLEAP-2存在糖基化位点(得分>0.5)，分别是第45、52位的丝氨酸残基(得分分别为0.746、0.705)。对丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化进行分析，结果见表2，有5个丝氨酸残基和3个苏氨酸残基存在8个磷酸化位点(得分均>0.5)，但没有酪氨酸的磷酸化位点。推测不同的位点可被不同的激酶引发磷酸化。

表2　cLEAP-2的磷酸化位点预测

注：PKC为蛋白激酶C，PKA为蛋白激酶A，PKG为蛋白激酶G，cdc2为细胞分裂周期蛋白2，cdk5为细胞周期素依赖蛋白激酶5，RSK为核糖体S6激酶，CKⅡ为酪蛋白激酶2，unsp为某种非特异性蛋白激酶(即不在系统中的某种激酶)。

2.7　抗菌肽cLEAP-2的三级结构预测

经软件分析，cLEAP-2的三级结构见图4。cLEAP-2的第37～76位氨基酸与SWISS-MODEL TEMPLATE LIBRARY中模板[2L1qA](99.9 Å) HUMAN LIVER EXPRESSED ANTIMICROBIAL的序列相似度为80%，E值为9.02×10-11，预测结果的QMEAN Z值为-1.13。cLEAP-2由α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲构成，与预测的二级结构结果一致。

2.8　抗菌肽cLEAP-2的功能结构域预测

经软件分析，cLEAP-2与Pfam数据库中LEAP-2的结构相似(E值为7.8×10-44)。cLEAP-2的第37～76位氨基酸与PDB：2L1q│A相似(E值为1.0×10-17)，第1～22位氨基酸残基为信号肽功能结构域，这与前面的预测结果相一致。Low complexity region位于第9～18位氨基酸残基(图5)。

2.9　抗菌肽cLEAP-2的抗原表位分析

经软件分析，由图6可知cLEAP-2的亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原性等指数。亲水性指数>0、抗原性指数>0、可及性指数>1时，可能存在抗原表位。据此综合分析，认为cLEAP-2可能存在多个抗原表位。

2.10　抗菌肽cLEAP-2的氨基酸系统进化

将鸡内源性抗菌肽cLEAP-2的氨基酸序列与其他42个物种的LEAP-2的氨基酸序列进行系统进化分析，获得系统树。由图7可知，鸡(Gallusgallus)内源性抗菌肽cLEAP-2与日本鹌鹑(Coturnixjaponica)LEAP-2的进化关系最近，而与漠林鼠(Neotomalepida)LEAP-2的进化关系最远。

3　讨论

鸡内源性抗菌肽LEAP-2是阳离子性抗菌肽[6]。本研究通过在线软件分析，发现cLEAP-2带11个正电荷的氨基酸残基和2个负电荷的氨基酸残基，分析其总体带正电荷，认为cLEAP-2是阳离子型抗菌肽。

一般认为，抗菌肽的分子量小，没有免疫原性[7]，且免疫学中认为分子量在10 000以上的物质有较好的抗原性[8-9]。cLEAP-2由76个氨基酸残基构成，分子量为8 835.65 u。然而，分子量虽小，但分子结构复杂的物质也具有抗原性[8]。抗原表位可由5～17个氨基酸残基构成[10]。经DNAStar软件分析，cLEAP-2可能存在几个抗原表位。因此，cLEAP-2存在抗原表位可能与其存在三维空间结构有关。但这还需要进一步深入探讨。

分析后发现cLEAP-2存在信号肽。这与高荣琨等的研究结果[11]相一致。信号肽可使新合成的多肽分泌到细胞外，从而发挥生理功能[12]。由此推测，cLEAP-2表达后，可到达细胞外发挥抗病原微生物等正常生理活性。同时，分析后发现，cLEAP-2定位于细胞核内，对该定位的生物学作用还有待深入研究。

螺旋结构是抗菌肽发挥抗菌活性的重要结构基础[13]。经分析，cLEAP-2的二级结构中存在多个α螺旋区及其他结构。可以推测，这些α螺旋可能是cLEAP-2发挥抗菌作用的结构基础。这一点得到功能结构域预测的佐证。

蛋白的磷酸化和糖基化可以改变蛋白的构象和增加蛋白的稳定性，从而调节蛋白的许多生物学功能[14-15]。经预测发现，cLEAP-2有2个糖基化位点和8个磷酸化位点。同时预测发现cLEAP-2是不稳定的疏水蛋白。因此，糖基化和磷酸化可能使cLEAP-2变得稳定，从而使得cLEAP-2能很好地发挥其功能。

从表11中可以看出：基于K-means算法的评选方法得到的结果都是2015级的班级，这是因为其年级较高，评价班级的相关属性基本都有取值，而传统评选方法得到的结果也基本都是较高年级的班级，同时，其存在部分属性取值较高的、发展失衡的情况。因此，采用基于K-means算法的优秀班集体评选方法，选取不同年级内均衡发展的优秀班集体，比传统评选方法更合理。

分子进化依赖于核酸和蛋白质的序列信息，是阐明物种间相互关系的分子基础[16]。通过系统发育树分析发现，鸡源抗菌肽LEAP-2与日本鹌鹑的LEAP-2之间的关系最近，表明抗菌肽LEAP-2在鸡和日本鹌鹑中相对保守。

耐药性或多重耐药性细菌与真菌的出现使得现有抗菌药物的疗效低下或无效，对人类和动物健康的威胁日趋严重[7，17]，寻找新的抗菌物质具有重要意义[18-19]，抗菌肽被认为是理想的抗生素替代物[17]。鸡体内的抗菌肽类型主要有β-防御素、cathelicidin和LEAP-2[1]，这几种抗菌肽在结构和功能上均有差异。目前，对鸡抗菌肽LEAP-2的研究还很少。因此，通过生物软件分析鸡抗菌肽LEAP-2的生物信息学内容为深入研究其功能与应用奠定基础。

4　结论

本研究结果揭示，鸡内源性抗菌肽LEAP-2为不稳定的、带正电荷的疏水性蛋白，有1个跨膜区和1个信号肽，有2个糖基化位点和8个磷酸化位点，二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，三级结构和功能结构域与人LEAP-2有很高的相似度，存在抗原表位，与日本鹌鹑有非常近的进化关系。

参考文献：

[1]胡建和，杭柏林，徐彦召，等. 动物源抗菌肽[M]. 北京：科学出版社，2005：76-78.

[2]Giuliani A，Rinaldi A C. Antimicrobial peptides：methods and protocols[M]. [S.l.]：Humana Press，2010：1-2.

[3]陈琛，王新华，薄新文. 绵羊生殖道抗菌肽[J]. 生物化学与生物物理进展，2009，36(11)：1483-1489.

[5]Krause A，Sillard R，Kleemeier B，et al. Isolation and biochemical characterization of LEAP-2，a novel blood peptide expressed in the liver[J]. Protein Science，2003，12(1)：143-152.

[6]Townes C L，Michailidis G，Nile C J，et al. Induction of cationic chicken liver-expressed antimicrobial peptide 2 in response toSalmonellaentericainfection[J]. Infection and Immunity，2004，72(12)：6987-6993.

[7]李瑞芳，卢研博，陈士华，等. 动物内源性多肽CGA-N46生物信息学分析[J]. 动物医学进展，2013，34(4)：43-46.

[8]崔治中. 兽医免疫学[M]. 2版.北京：中国农业出版社，2015：35-36.

[9]Day M J，Schultz R D. Veterinary immunology：principles and practice[M]. [S.l.]：Manson Publishing Ltd，2011：19-20.

[10]邬于川，左丽. 医学免疫学[M]. 北京：科学出版社，2014：22-25.

[11]高荣琨，翟晓西，白秀花，等. 鸡抗菌肽LEAP-2基因克隆及序列特征分析[J]. 畜牧与兽医，2013，45(8)：85-87.

[12]韦雪芳，王冬梅，刘 思，等. 信号肽及其在蛋白质表达中的应用[J]. 生物技术通报，2006，22(6)：38-42.

[13]董天堂，田子罡，王建华. α-螺旋形抗菌肽结构参数与功能性的关系[J]. 中国生物工程杂志，2007，27(9)：116-119.

[14]章晓联. 蛋白糖基化与免疫[J]. 中国免疫学杂志，2004，20(4)：290-293.

[15]刘东花，卫阳飞. 牦牛HSPB6 基因的生物信息学和表达分析[J]. 华北农学报，2016，31(1)：35-39.

[16]刘振宇，谢荔岩，吴祖建，等. 孔石莼质体蓝素氨基酸序列分析和分子进化[J]. 分子植物育种，2005，3(2)：203-208.

[17]韩文瑜，孙长江. 抗菌肽的研究现状与展望[J]. 中国兽药杂志，2009，43(10)：11-19.

[18]裘纪莹，陈相艳，吴发萍，等. 解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7菌株高产抗菌物质的发酵条件优化[J]. 江苏农业科学，2016，44(1)：311-315.

[19]吴永继，宋剑武，孙燕杰，等. 穿心莲水提物联合抗菌药对含fosA3大肠杆菌的作用[J]. 江苏农业科学，2016，44(6)：348-351.