互叶白千层内生真菌鉴定及耐精油菌株筛选

余　波， 傅科鹤， 杜尚广

(南昌师范学院生物系，江西南昌 330032)

植物内生菌是一类广泛分布在植物组织内，对植物不产生明显病理影响的微生物类群，而国内外对植物内生菌的详细研究始于20世纪80年代[1]。绝大部分内生菌的生活史都在植物体内完成，而植物体内是一个相对封闭的内环境：充足的养分、适当的氧气、少量的竞争对手。在植物-内生菌长期共生过程中，内生菌能够利用环境中的前体物质合成与植物相似的次生代谢产物，这种特性在一些重要的药用植物中显得尤其重要和有意义。如傅科鹤等从产抗癌药物紫杉醇的红豆杉内生真菌中分离得到1株曲霉属内生真菌，从其发酵产物中获得5种化学成分，其中一种对肿瘤细胞有明显的抑制作用[2]。在我国，围绕药用植物内生菌的生理活性物质研究是当前的热点。

互叶白千层(Melaleucaleucadendron)是桃金娘科(Myrtaceae)白千层属(Melaleue)的一种多年生常绿小灌木，原产于澳大利亚东部的昆士兰州和新南威尔士州的北部海岸一带。20世纪80年代后，我国、印度和东南亚的一些国家开始引种。互叶白千层新鲜枝叶提取得到的精油俗称茶树精油，它是一种广谱的杀菌剂，其产品广泛应用于化妆、医药、食品等行业，具有较高的经济价值[3]。茶树精油的广谱抑菌特性，使其在替代化学农药方面具有较大的应用潜力[4]。目前，研究认为茶树精油通过破坏膜结构[5]，抑制微生物呼吸途径中线粒体酶、脱氢酶的活性，从而影响细胞呼吸作用[6]、干扰胞内大分子物质活性[7]等形式达到杀菌作用。然而，对于其详细的杀菌机制研究还不足。由于长期与植物共生，互叶白千层内生真菌对精油都具有一定的抗性。从中筛选高耐受精油的菌株具有更大的概率，可以缩短筛选周期，提高效率。因此，本研究从互叶白千层内生真菌中筛选高耐受精油的真菌，并对互叶白千层内生真菌的多样性进行初步分析。后期将挑选同属内抗性强弱有明显差异的2株菌株进行比较基因组学及转录组的研究，从分子水平上解释茶树精油的抑菌机制，深化对茶树精油抑菌作用机制的理解，为更高效地利用茶树精油抑菌提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1植株及精油互叶白千层采自江西省抚州地区，4-松油醇型；互叶白千层精油经蒸馏法提取所得。

1.1.2试剂氨苄青霉素、链霉素购自Amresco公司，配成100 mg/mL，0.45 μm滤膜无菌过滤，分装成小管，-20 ℃冻存备用。

1.1.3培养基PDA培养基：马铃薯去皮200 g，葡萄糖 20 g，琼脂15 g，水1 L。

马丁氏培养基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1%孟加拉红水溶液 3.3 mL，琼脂粉15.0 g，蒸馏水1.0 L。

查氏培养基：NaNO33.00 g，K2HPO4·3H2O 1.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，KCl 0.50 g，FeSO40.01 g，蔗糖 30.00 g，琼脂15.00 g，蒸馏水1.00 L。

1.2　方法

1.2.1内生真菌分离、纯化分别取互叶白千层的根、茎、叶部位，用清水洗净后置于纱布上晾干；在无菌操作台上，将根、茎、叶浸没于装有20%次氯酸钠的培养皿中2 min，然后转移至无菌水中漂洗1 min，再转至70%乙醇中30 s，最后用无菌水漂洗1 min；表面消毒处理后的样品转至无菌滤纸上，吸干水分后剪成1 m3大小的组织块，接种于含抗生素的孟加拉红培养基上，每皿间隔放置10个样品，28 ℃倒置培养，及时将生长的菌株转移至新的培养基。

1.2.2抑菌试验茶树精油用甲醇稀释到35%(体积分数)的浓度后，取200 μL涂布于PDA平板(直径8.5 cm)上，晾干10 min后，接种内生真菌菌饼(直径0.5 cm)，每皿接5个，重复3次，28 ℃倒置培养，及时测量菌落直径，以甲醇作为空白对照。

1.2.3真菌鉴定

1.2.3.1形态学鉴定挑取活化后的真菌菌丝，分别接种于PDA与察氏培养基中培养，肉眼观察菌落正反面形态特征；采用插片法及玻璃纸法进行孢子形态观察，参照《真菌鉴定手册》进行菌种形态学鉴定。

1.2.3.2分子生物学鉴定采用CTAB法提取真菌基因组DNA后，通过ITS1～ITS4引物对扩增后，测序，NCBI比对后鉴定菌种。

2　结果与分析

2.1　互叶白千层内生真菌的分离鉴定

由表1可知，共分离纯化获得内生真菌149株，其中根中分离到35株，茎中分离到102株，叶中分离到12株。经形态学鉴定，共分为链格孢属、青霉属、曲霉属、炭疽属、镰孢霉属、木霉属等6属。其中根部主要是镰孢霉属、木霉属等土壤习居种类占优势；茎部优势菌群为链格孢属，且总体数量最多；叶部菌群种类较单一，数量很少，主要是炭疽属与链格孢属2类。

表1　互叶白千层内生真菌鉴定

2.2　耐受茶树精油内生真菌筛选

2.2.1抑菌精油浓度的确定茶树精油具有广谱的抑菌效果，对细菌、真菌都有明显的抑制能力。然而，不同来源及不同萃取手段获得的精油抑菌IC50是不同的。为了确定合适的抑菌浓度，设置3种不同的精油浓度(甲醇溶解)——15%、35%、50%，随机挑选40株内生真菌进行最佳浓度确定。表2结果表明，50%浓度过高，只有1株(2.5%)菌株能够生长，获得耐受菌株的数量过少，不利于后续研究；15%浓度偏低，32株菌株(80%)都能够生长，与不加精油的培养基(对照)相比，只有3株受到10%以上的抑制；35%浓度有5株菌株(20%)能够生长，完全不受抑制的有2株。综合考虑筛选数量与浓度的关系，挑选35%的精油用于耐受菌株的筛选。

表2　抑菌精油浓度的确定

注：抑制率=(对照培养基菌落直径-对应的精油培养基菌落直径)/对照培养基菌落直径×100%。

2.2.2耐受精油内生真菌筛选通过精油抗性筛选，从149株内生真菌中筛选得到5株能够在含35%精油的PDA平板上正常生长的菌株(表3)。其中编号为Ml10的菌株抗性最强，生长4 d后菌落直径可达到5.30 cm，显著高于其他4株菌株(P<0.05)。

表3　互叶白千层内生真菌耐精油菌株筛选

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3　耐受精油菌株鉴定

2.3.1菌株Ml10形态学鉴定菌株Ml10在PDA平板上生长迅速，4 d即长满平板并开始产孢。菌落初期为白色，气生菌丝发达，菌落中间由内到外产绿色孢子，菌落背面无色。孢子梗环状排列，主枝树状，分枝多，瓶梗短，基部细，分生孢子球形(图1)。菌株Ml10初步鉴定为康宁木霉(Trichodemakonigii)。

2.3.2菌株18S rDNA鉴定通过CTAB法提取菌株Ml10的DNA(图2-A)，然后以引物ITS1F/ITS4R扩增其ITS序列(图2-B)。结果表明，扩增片段为610 bp；通过测序后NCBI比对分析，该菌株与康宁木霉的ITS序列100%配对，结合形态学鉴定结果，确定该菌株为康宁木霉。

3　结论与讨论

本研究分离获得的菌株Ml10来自互叶白千层的根部，通过形态学鉴定后属于木霉属真菌。木霉菌属于土壤常见的生防菌，在多种植物根部都有定植现象[8]。由于长期定植在互叶白千层根部，内生菌对精油具有明显的抗性[9]。后期研究将通过比较基因组学、蛋白质组学及代谢组学技术，从DNA和蛋白质水平分析这些菌株抗茶树精油的机制，从而可以补充和完善茶树精油抑制真菌机制理论，为更高效地利用茶树精油提供理论依据[10]。

参考文献：

[1]Nisa H，Kamili A N，Nawchoo I A，et al. Fungal endophytes as prolific source of phytochemicals and other bioactive natural products：a review[J]. Microbial Pathogenesis，2015，82：50-59.

[2]傅科鹤，章初龙，刘树蓬，等. 南方红豆杉内生真菌的抗菌活性[J]. 植物保护学报，2006，33(3)：268-272.

[3]Janssen A M，Scheffer J J C，Svendsen A B. Antimicrobial activities of essential oils[J]. Pharmaceutisch Weekblad，1987，9(4)：193-197.

[4]Thomsen N A，Hammer K A，Riley T V，et al. Effect of habituation to tea tree (Melaleucaalternifolia) oil on the subsequent susceptibility ofStaphylococcusspp. to antimicrobials，triclosan，tea tree oil，terpinen-4-ol and carvacrol[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2013，41(4)：343-351.

[5]Rodney J，Sahari J，Kamal M S M，et al. Thermochemical and mechanical properties of tea tree (Melaleucaalternifolia) fibre reinforced tapioca starch composites[J]. E-Polymers，2015，15(6)：401-409.

[6]Cox S D，Mann C M，Markham J L，et al. Determining the antimicrobial actions of tea tree oil[J]. Molecules，2001，6(2)：87-91.

[7]Chami N，Bennis S，Chami F，et al. Study of anticandidal activity of carvacrol and eugenolinvitroandinvivo[J]. Molecular Oral Microbiology，2005，20(2)：106-111.

[8]Harman G E.Trichoderma—Not just for biocontrol anymore[J]. Phytoparasitica，2011，39(2)：103-108.

[9]Deshmukh S K，Verekar S A，Bhave S V. Endophytic fungi：a reservoir of antibacterials[J]. Frontiers in Microbiology，2015，5：715.

[10]Ramadass M，Thiagarajan P. A review onMelaleucaalternifolia(tea tree) oil[J]. International Journal of Pharma and Bio Sciences，2015，6(4)：655-661.