拟茎点霉B3对稻秆-猪粪-蘑菇渣堆肥腐熟进程与品质的影响

孙　旭， 郝玉敏， 蔡金傍， 戴传超

(1.南京大学生命科学学院，江苏南京 210023； 2.环境保护部南京环境科学研究所，江苏南京 210042；3.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046)

我国农业废弃物种类繁多且数量巨大，其中农作物秸秆年产量约为7×108t，秸秆中含有大量的有机质及微量元素，是一种综合利用价值较高的可再生资源[1]。但目前我国秸秆利用方式相对粗放，除直接还田以及作为燃料、饲料外，每年约有2×108t秸秆未经处理在田间堆放或焚烧，造成巨大的资源浪费和环境污染[2]。

堆肥是农业秸秆减量化和资源化最为经济有效的方式之一，但由于秸秆中含有大量的木质素、纤维素和半纤维素等难降解成分，导致自然堆肥腐熟时间长、产品质量差，不利于高效利用秸秆[3-4]。研究表明，接种外源功能微生物可以有效地促进木质素等物质的降解，加快堆肥腐熟进程，提高发酵物肥力[5-7]。

内生真菌生长在植物内部，它对植物的侵染过程也是水解木质素和纤维素的过程，研究表明部分内生真菌可降解纤维素并产生油脂，对植物凋落物具有较强的降解能力[8]。史央等从重阳木中分离出1株植物内生真菌拟茎点霉B3，可离开宿主存活于土壤中，该B3菌能分泌漆酶，促进土壤纤维素酶活性，加快茅苍术凋落物和花生秸秆的降解[9-11]。本研究以拟茎点霉B3为外源接种菌剂，研究其对稻秆猪粪堆肥进程及产品质量的影响，以期为农业废弃物资源化利用提供技术支撑。

1　材料与方法

1.1　试验材料

试验所用水稻秸秆为江苏省农业科学院提供的长度为 1～2 cm 的干碎料；猪粪采自镇江三明生物工程有限责任公司的新鲜猪粪；蘑菇渣为金坛阿波罗生物制品有限公司提供的金针菇发酵物，3种物料的基本特性如表1所示。植物内生拟茎点霉属菌株B3(Phomopsisliquidambari)分离自重阳木；水堇种子购于江苏宿迁鑫岩花卉园。

表1　3种试验物料的基本性质

1.2　稻秆猪粪腐熟试验

拟茎点霉B3菌剂制备：拟茎点霉B3以马铃薯葡萄糖液体培养基培养，500 mL三角瓶中固体发酵培养基质麸皮 ∶糠 ∶稻壳=6 ∶3 ∶1(质量比)，按料液比1 g ∶1.2 mL加入灭菌水。拟茎点霉B3菌液以10.0%接种量接入固体培养基中，搅拌均匀后在28.0 ℃条件下静置培养1周，有效活菌数达到 104CFU/g。

堆肥试验于2012年12月13日至2013年1月14日进行。采用6个口径为27.0 cm、高为20.0 cm的花盆进行试验，每个花盆内含500 g水稻秸秆，300 g蘑菇渣，300 g猪粪，混匀后碳氮比约为28.0。随机选取3个花盆作为B3处理组，分别加入 150 g 的B3固体发酵物，另设3个不加任何处理的空白对照组(CK)。加入一定量蒸馏水，调节含水率在70.0%左右，进行好氧高温发酵，堆肥时间设为32 d。从堆肥当天开始每8 d从堆体取100 g左右样品，一部分样品用自封袋密封，保存于4.0 ℃冰箱中，用于E4/E6值、种子发芽指数和微生物数量的测定；另一部分样品于105.0 ℃条件下烘干粉碎过 0.8 mm 筛，用于测定有机质、营养成分、木质素、纤维素的含量。

1.3　测定方法

E4/E6值测定方法[12]：称取2.5 g堆肥样品于50 mL离心管中，加入25 mL蒸馏水，离心后取上清液，用分光光度计分别在465、665 nm处测定吸光度，计算其比值。

种子发芽指数测定[13]：称取5 g鲜样放于三角瓶中，加入50 mL蒸馏水，充分振荡，30 ℃条件下浸提24 h，过滤取6 mL滤液加到铺滤纸的培养皿中，将10粒水堇种子置于其中，室温条件下放置48 h，每个处理重复3次，同时以蒸馏水为对照，测定发芽指数。

有机质含量采用重铬酸钾氧化法[14]测定；全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾含量参照土壤测试方法[15]测定；木质素含量采用浓硫酸法[16]测定；纤维素含量采用改进的浓酸水解定糖法[16]测定；微生物数量采用平板稀释法[14]测定。

1.4　数据分析

试验结果以算术平均数±标准误表示，采用SPSS 13.0软件进行数据方差分析(One-way ANOVA)检验处理间的差异显著性。Duncan’s法进行多重比较。

2　结果与分析

2.1　稻秸猪粪发酵物有机质含量变化

由图1可知，不同处理堆肥过程中有机质含量整体呈下降趋势。接种拟茎点霉B3能够促进有机质的分解，在堆肥升温期和高温期(0～16 d)微生物代谢活动较旺盛，有机质被大量分解。在16 d时，CK和B3处理堆肥中有机质含量分别为483.6、362.2 g/kg，比开始时减少18.0%(P<0.05)和 44.3%(P<0.01)；在后腐熟阶段，大部分易降解有机质被分解，微生物活性减弱，有机质降解速率变慢并趋于稳定，在 32 d 时CK和B3处理分别比开始时有机质含量减少21.2%(P<0.01)和44.3%(P<0.01)。表明接种外源功能微生物可以促进稻秆猪粪堆肥有机物质的降解，加快堆肥反应进程。

2.2　稻秆猪粪发酵物E4/E6值的变化

在降解过程中稻秆猪粪产生了大量的腐殖酸，其含量是堆肥腐殖化的一个重要指标，可用来判断堆肥腐熟程度。堆肥腐殖酸在465、665 nm处具有特征吸收峰，其在465、665 nm处吸光度比值(E4/E6)通常被用来反映腐殖质的缩合和芳构化程度，通常E4/E6比值越低，腐殖化和聚合程度越高，分子量越大。由图2可知，接种B3处理堆肥E4/E6值呈先上升后下降的趋势，在8 d时达到最大值3.0，之后迅速下降，在24 d时B3处理堆肥中E4/E6值为1.6，比开始时下降43.9%，此时降解物的芳构化程度较高，形成大量的腐殖质。接种B3处理堆肥E4/E6值较CK低(P<0.01)，结果表明，添加菌剂能促进腐殖质的缩合和芳构化，加快稻秆腐殖化，形成更加稳定的腐殖质。

2.3　稻秸腐熟过程中纤维素、木质素含量的变化

水稻秸秆主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，含量分别在36.7%、24.8%、25.2%左右，这类物质不易降解，导致自然堆肥腐熟时间较长、堆肥产品质量差，不利秸秆的高效利用。

2.3.1纤维素含量变化由图3可知，在腐熟过程中B3处理的纤维素含量一直在下降，而纤维素的降解率持续上升。在前16 d内纤维素降解较快，CK和B3处理的纤维素含量分别下降15.3%、39.2%。堆肥结束时对照和B3处理堆肥中纤维素含量分别为24.3%、16.7%，分别比开始时下降30.7%、50.5%，表明接种B3菌有利于纤维素的降解。

2.3.2木质素含量变化水稻秸秆腐熟过程中木质素的降解最为缓慢。由图4可知，对照组木质素的含量一直在下降，从开始的25.7%降至32 d的17.2%，下降 33.1%；接种B3处理堆肥中木质素经16 d的降解，含量从开始的24.1%降至15.1%(P<0.01)，下降37.3%，后16 d降解较为缓慢。表明内生拟茎点霉B3在水稻秸秆木质素降解过程中起了很大的作用。

2.4　稻秸腐熟过程中微生物数量的变化

堆肥是以微生物为媒介的复杂生化过程，细菌、真菌、放线菌在有机质的降解中发挥着重要作用，其数量在堆肥的不同阶段是不同的。

2.4.1细菌数量变化细菌是堆肥腐熟过程中数量最多的微生物，可快速分解糖类、淀粉和蛋白质类易降解物质，部分细菌也参与纤维素的分解，进行自身生长代谢和产生热量。由图5可知，除B3处理32 d堆肥样品外，不同处理堆料中细菌数量呈先上升后下降的趋势。堆肥升温期，堆料中易降解物质较多，细菌迅速繁殖，在堆肥高温期，大多数细菌死亡，细菌数量降低，接种B3处理比对照处理的堆料中细菌数量多。堆肥开始时B3处理和对照的细菌数量分别为3.2×109、1.8×109CFU/g，分别在8、16 d时达到最大值，分别为5.5×109CFU/g和3.2×109CFU/g，接种B3处理细菌数量比对照处理高71.9%。表明接种外源功能菌B3有利于细菌的生长，能加速堆肥发酵的启动，促进有机质的降解。

2.4.2放线菌数量变化稻秆猪粪堆肥腐熟过程中放线菌的数量低于细菌和真菌，呈现先上升后下降的趋势。由图6可知，在堆肥前期放线菌数量逐渐升高，接种B3处理放线菌数量在8 d时达到最大值，为3.8×108CFU/g，比对照放线菌数量高65.2%(P<0.05)；在高温期放线菌数量维持在一个较高的水平，而在降温期放线菌数量持续下降。研究表明，在高温期纤维素和木质素的分解主要由放线菌完成，其数量和种类也会有所增加[17]。接种内生拟茎点霉B3明显增加堆肥腐熟过程中放线菌数量，产生更多的木质纤维素分解酶类，加速木质素的降解，从而促进水稻秸秆的腐熟。

2.4.3真菌数量变化堆肥腐熟过程中真菌数量的变化趋势与细菌相似，但数量低于细菌。由图7可见，在堆肥前期真菌数量持续升高，接种B3处理真菌数量在8 d时达到最大值，为2.6×109CFU/g，比对照真菌数量高83.8%(P<0.05)；在高温期大部分真菌处于休眠状态或死亡，导致其数量急剧下降；在堆肥结束时接种B3处理真菌数量达到 2.6×108CFU/g，比对照真菌数量高25.7%(P<0.05)，且低于堆肥起始的真菌数量。

2.5　稻秸猪粪发酵物对种子发芽指数的影响

种子发芽指数(germination index，简称GI)常被用来测定堆肥的生物毒性，它是表征堆肥腐熟水平的重要生物学指标之一。一般认为，当GI大于50.0%时，可认为堆肥发酵物对作物基本无毒性，堆料基本腐熟；当GI大于80.0%时，堆料已没有植物毒性且已腐熟。由图8可知，不同处理的堆肥发酵物GI呈先下降后上升的趋势。堆肥开始时有机质未分解，对植物抑制作用小，B3和CK的GI分别为87.0%、77.0%(P<0.05)，由于接种B3后加快了有机质的降解，产生了较多的有毒物质(氨和低级脂肪酸等)，抑制了水堇种子的发芽，在 8 d 时B3处理的GI为63.0%，低于CK的73.0%。随着堆肥的进行，有毒物质减少，16 d时B3处理堆肥GI达到80.0%，显著高于CK处理的67.0%(P<0.05)，表明堆肥已达到腐熟状态，堆肥结束时B3处理和CK处理堆肥GI分别为83.0%和77.0%。结果表明，接种拟茎点霉B3有助于降低堆肥发酵物植物毒性，加快堆肥腐熟进程。

2.6　稻秆猪粪发酵物养分含量的变化

堆肥过程是一个复杂的生物化学过程，伴随着有机物的降解及氮、磷、钾的释放和固定，氮、磷、钾的含量直接影响最终堆肥产品质量。堆肥产品的养分含量是评价堆肥产品质量的标准之一。水稻秸秆和猪粪经过32 d好氧高温堆肥后，不同处理的堆肥产品品质有所差异，接种拟茎点霉B3能明显提高堆肥产品中养分含量。由表2可知，B3处理堆肥中全氮和速效氮含量分别增加23.7%(P<0.05)和19.9%(P<0.05)；全磷和速效磷含量分别增加33.3%(P<0.05)和 35.3%(P<0.05)；全钾和速效钾含量分别增加14.3%(P>0.05)和9.2%(P>0.05)。

表2　堆肥产品养分含量

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

3　结论与讨论

堆肥是在微生物的作用下，将复杂的有机物分解为细胞可利用的小分子物质，并形成稳定腐殖质的过程。自然堆肥腐熟时间长、产品质量差，不利于农业废弃物的高效利用，微生物接种技术具有使堆体快速升温、无二次污染、提高堆肥质量的优点，因此被广泛应用在堆肥中[3]。大量的研究表明，接种微生物菌剂能增加堆肥初期微生物数量，提高微生物代谢活性，加快有机物的降解，促进堆料的腐熟，例如在堆肥初期接种芽孢杆菌和链霉菌，可在堆肥过程中增加细菌数量，加速有机质分解[18]；接种EM菌剂(effective microorganisms)有利于堆肥矿化作用，缩短堆肥腐熟时间5～8 d[19]。

拟茎点霉B3是从重阳木中分离得到的1株植物内生真菌，可离开宿主在土壤中存活30 d，能与大多数微生物形成互利共生关系[10]。该B3菌能分泌降解木质素的关键酶——漆酶，粗酶液经50 ℃处理1 h后，仍能保持83.1%的活性，且pH值在6～8时，酶活较为稳定，从而促进堆肥过程中木质素和纤维素的分解[11，20]。当环境中可利用的营养物质匮乏时，拟茎点霉B3可被诱导产生纤维素酶和木质素酶，加快茅苍术凋落物和花生秸秆的降解[10，21]。本研究在稻秆猪粪堆肥初期接入有效活菌数为104CFU/g的拟茎点霉B3菌剂，结果表明，与对照相比，接种拟茎点霉B3菌剂能增加堆肥升温期和高温期细菌、真菌、放线菌的代谢活性和细胞数量，其中有些放线菌能产生木质纤维素的分解酶类，例如放线菌(Streptomycessp.)在以秸秆为唯一碳源时能产生大量的纤维素酶，在70 ℃时仍具有较高的酶活性[22]；在牛粪堆肥中存在大量的高温放线菌GPL 1可产生完整的纤维素酶系，对甘蔗、滤纸、微晶纤维素等均具有较好的降解作用，从而促进有机质、木质素、纤维素的降解，形成更加稳定的腐殖质[23]。种子发芽指数是评价堆肥腐熟效果和生物毒性的关键指标，接种拟茎点霉B3的处理在16 d时种子发芽指数达到 80.0%，远高于对照的67.0%，表明堆肥完全腐熟且无生物毒性。因此，接种拟茎点霉B3能加快堆肥腐熟进程，缩短腐熟时间。

堆肥过程中有机物被不断分解，同时由于含水率的下降，堆体中无机营养成分会产生“浓缩效应”，使养分相对含量增加，有利于提高堆肥产品质量。接种拟茎点霉B3菌剂的处理经32 d腐熟后，堆体中全氮、速效氮、速效磷含量显著增加，与前人研究结果[24]一致。有一些菌种虽然对秸秆的降解能力强，但同时也是植物致病菌，不能作为秸秆腐熟菌剂，研究表明，拟茎点霉B3不仅对水稻、大豆、花生等作物生长无毒害作用，还能促进水稻分蘖、大豆结瘤、缓解花生连作障碍等[9，25-26]。

稻秆猪粪在自然堆肥过程中，有机质、纤维素、木质素降解缓慢，形成稳定腐殖质的时间长，堆肥产品养分含量和种子发芽指数较低，腐殖化进程较慢。向稻秆猪粪高温堆肥中添加内生拟茎点霉B3菌剂，能增加堆肥升温期和高温期微生物的数量，加速有机质、纤维素、木质素的降解，缩短腐殖质的形成时间，提高堆肥产品中全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾含量，提高种子发芽指数，减少对植物生长的抑制，提升堆肥产品品质。

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