一种大小鼠明暗箱图像分析处理系统的研制

张宏霞，吕静薇，张北月，董黎明，李 由，陈晓萍，陈善广*，刘新民,*

(1.湖南中医药大学，长沙 410208； 2.中国医学科学院，北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193； 3.中国航天员科研训练中心人因工程重点实验室，北京 100094； 4.北京中医药大学，北京 100029)

明暗箱实验(light/dark box test，LDB)，是一种使用较为广泛的行为学检测方法[1-2]，用来筛选和评价抗焦虑药物的活性，同时也可用于焦虑症病理机制的研究[3]。因明暗箱实验具有操作简单且不需要事先训练动物[4]的优点，自1980年Crawley等[5]建立至今，已经成为经典的评价啮齿类动物状态性焦虑和特质性焦虑行为学方法[6]。明暗箱利用啮齿类动物喜欢探究新奇环境，但又因厌恶明室中亮光而被迫退却，由此形成矛盾冲突状态，使穿箱次数减少。抗焦虑药物可显著增加鼠的穿箱次数以及在明室时间[7]。

作者在抗焦虑中药药理实验研究过程中，参考国内外已有的抗焦虑研究方法，结合医学动物行为学、计算机科学、机械工程学，利用计算机视频采集技术和图像分析技术，研制了明暗箱实验图像分析处理系统，实现了明暗箱实验图像分析系统的高自动化、提取信息量大、指标敏感而丰富、图像信息形象而生动。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性 Wistar大鼠100只，体重220～250 g，6～7周龄，由北京维通利华实验动物公司提供[SCXK(京)2016-0011]。全部动物实验在中国医学科学院药用植物研究所动物房进行[SYXK(京) 2013-0023]。动物适应环境5 d后进行实验，实验期间自由供给标准饲料和清洁自来水，12 h∶12 h(光∶暗)，室温22℃～25℃，湿度条件为(55±10)%。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要仪器

灰白色铝合金材料、防反光的黑色糙面金属材料、电路控制模块(固态继电器、电源、转换器等)、发光二极管、工业摄像机(VS-250DH，分辨率752×582)、镜头(AFT-VS0410ZM)，镜头可变焦3.5～8 mm)、红外截止滤镜、视频线、CAN现场总线，CAN现场总线接口卡(KPCI-8110)、计算机主机(9寸显示屏，双核，Intel i5 处理器，Windows 7系统，内存容量4 G，硬盘内存 1 TB，三个以上 USB 接口，刻录光驱)、显卡、单片机MCU、图像采集卡(微视E413,总线数据传输速率可达250 MByte/S, 9 bit 的视频 A/D, 8路的TTL输入/输出控制)、采样速率每秒25帧、打印机。

1.3 大、小鼠明暗箱图像分析处理系统的建立

1.3.1 硬件的研制

明暗箱实验系统采用摄像视频跟踪技术识别目标，获取动物在明暗箱中活动情况。明暗箱硬件由测试箱、CAN现场总线、工业摄像机、图像采集卡、电路控制模块等组成。大鼠明暗测试箱尺寸为：61 cm × 46 cm×100 cm(长×宽×高)，小鼠明暗测试箱尺寸为：40 cm ×15 cm ×100 cm(长×宽×高)。明暗测试箱为灰白色铝合金的封闭测试箱体(1)，箱体内部用隔板(4)分隔成明暗两室，明室顶部装有白光灯，照度可调为0到1200 lux，暗室照度为2 lux，隔板下方有一小门(8)相通。测试箱顶部为控制电路板(2)，顶部中间位置安装有摄像头(3)，摄像头上装有红外截止滤镜，侧面装有红外背景光源(7)(波长850 nm，侧面平行照射，安装于 2 倍于老鼠身体高度的位置[8]，高度约为(7～10 cm)，底部为不锈钢栅(9)，钢栅下方有用于收集动物的排泄物的活动抽屉(10)。CAN现场总线(11)接收软件发送的指令，开启红外光，工业摄像机(3)实时采集明暗箱测试仪中动物的活动情况，图像采集卡将采集到的模拟信号转化为数字信号，软件对传送的数字信号进行处理分析。明暗箱图像分析处理系统见图1。

注：(1)测试箱体；(2)控制电路；(3)摄像头；(4)隔板；(5)观察窗；(6)门；(7)红外灯阵列；(8)通道；(9)钢栅；(10)粪便收集板；(11)CAN现场总线；(12)电源线；(13)实验软件系统。图1 明暗箱图像分析处理系统示意图Note.(1)Light/dark box,(2)Circuit,(3)Cameras,(4)Baffle plate,(5)Observation window,(6)Door,(7)Infrared lamp,(8)Corridor,(9)Grid,(10)Fecal collection plate,(11)Controller area network,(12)Power line,(13)Software.Fig.1 Schematic diagram of the structure of the computeraided-controlling and image analysis system for light/dark box test

1.3.2 软件的研制

明暗箱实验系统软件利用Microsoft Visual C++6.0编程，可用于Windows 7、Windows XP操作系统，采用阈值分割法识别明暗箱中的动物，边缘法计算动物的质心并跟踪动物的运动轨迹，扣除“本底噪音”方式[8]以及阈值法[9]，剔除多种噪声。其中明暗箱实验软件利用E413采集卡的SDK开发了视频采集模块，实现对明暗箱中大、小鼠行为表现的准确采集与分析；加入Open CV开发包，实现高效的标准化图像处理；研制直方图均衡化图像增强方法，实现了图像自动二值化功能、基于对话框的手动二值化功能和大、小鼠轮廓的全自动提取和质心计算等功能。明暗箱实验实时分析处理系统图像处理流程，参见图2。

注：(A)背景图像取偶行；(B)实时图像取偶行；(C)平滑；(D)相异/相减；(E)设置ROI；(F)二值化；(G)形态学；(H)掩码；(I)提取轮廓；(J)找最大轮廓求质心；(K)取消ROI；(L)对两只老鼠分别进行。图2 明暗箱图像分析处理系统图像处理流程Note.(A) Background image. (B) Real-time image. (C) Smoothing. (D) Subtraction. (E) Set ROI. (F) Binary threshold. (G) Morphology. (H) Mask image. (I) Extract contours. (J) Find the longest contour and get the mass center. (K) Unset ROI. (L) For each of the two mice.Fig.2 A diagram of the software of the computer-aided-controlling and image analysis system

明暗箱图像分析处理系统软件由实验方案、参数设置、实验控制、数据分析与轨迹回放4大功能模块组成。实验方案：实验时间、实验名称、动物品系、药品名称、动物分组等实验信息。实验设置：包括任务参数和实验参数。任务参数:实验保存目录、实验名称、操作人员等基本信息；参数设置：包括实验阶段、适应时间、实验时间、明暗区域比例的调节、灰度阈值的设置、相机提取阈值的改变等。实验控制：实验流程控制、实验条件信息的显示、动物活动视频实时监控与指标的实时显示。点击实验开始后，实验系统自动识别动物，记录动物位置的变化，提取得到带时间坐标的多维活动轨迹，并根据实验条件，自动控制实验流程。数据分析：数据保存、查看及重新处理。实验结束后实验人员可根据需求，选择分析的实验数据、行为学指标以及可提取动物的图像信息。实验数据自动将结果保存为Excel文件。该软件可提取26项直观、科学的行为学指标信息。其中包括：入明/入暗潜伏期、入明/入暗次数、穿箱次数、明室(暗室)时间等基本的评价指标；运动时间、静息时间、明室/暗室运动时间、明室/暗室静息时间、总路程、明室/暗室路程、运动速度等其余判断的指标。同时该软件可实时提取动物的多种图像信息，包括视频图像、轨迹图、热点图以及轨迹热点复合图等。明暗箱图像分析处理系统软件轨迹热点图，见图3。

明暗箱实验图像分析处理系统软件界面采用结构化、模块化的设计风格，操作简洁方便，由图像显示区、参数设置控制区、实时结果输出区三部分构成。明暗箱实验图像分析处理系统软件界面图，参见图4。

图3 明暗箱图像分析处理系统轨迹热点图Fig.3 Diagram of trajectory and hot spot map of the computer-aided-controlling and imageanalysis system for the light/dark box test

图4 明暗箱实验图像分析处理系统软件界面图Fig.4 Software interface of the computer-aided-controlling and image analysis system for light/dark box test

1.4 明暗箱图像分析处理系统验证

1.4.1 明暗环境的验证

雄性 40只Wistar大鼠，随机分为两组：A组(明室无灯组)20 只；B组(明室有灯组)20只。在测试房适应1 h，进行明暗箱实验实验，历时1 d，每天 1 次，每次5 min，均于当日 8:00～12:00 am进行。实验时打开红外背景灯，实验人员通过视频监控实验过程，同时录制视频以提高人工记录的准确度。明室灯光照度为400 lux，暗室照度为2 lux。实验中 A组关闭明室白光灯，B组则开启明室白光灯，所有动物均背朝通道放入明室位置[10]，用秒表记录动物在明室和暗室停留时间，以及记录穿箱次数。

1.4.2 运动阈值的确认

雄性 Wistar大鼠40只，在测试房适应1 h后，进行明暗箱实验。实验在一天内完成，首先打开明暗箱计算机图像实时分析处理系统，开启明室内白光灯(明室灯光照度为400 lux[5,11]，暗室照度为2 lux)，设置实验时间为5 min。将动物背朝通道，放入明室内，实验过程中，人工记录动物的运动时间(以动物四肢移动作为判断其运动的标准)，同时软件根据不同的运动阈值(运动阈值取9、18、27、36、45、54 cm/s)，分析得到不同的运动时间。实验后，将人工记录的运动时间与软件记录的运动时间进行相关性分析[12]，确定最佳的运动阈值。

1.4.3 指标可靠性验证

雄性 Wistar大鼠20只，在测试房适应1 h后，进行明暗箱实验。实验历时1 d，打开明暗箱计算机图像实时分析处理系统，开启明室白光灯(明室灯光照度为400 lux，暗室照度为2 lux)，设置实验时间为5 min，将动物背朝通道门放入明室，允许其在明暗室内自由活动，检测5 min内动物穿箱次数、入暗次数、明室时间以及暗室时间等指标，并将人工记录数据与软件分析结果进行相关性分析。

1.4.4 明暗箱实验实时检测分析处理系统的应用

雄性Wistar大鼠40只，随机分为两组：A 组(正常组为明室无灯组)，20 只；B 组

(模型组为明室有灯组)，20只。在测试房适应1 h，进行明暗箱实验实验，历时1 d，每天1次，每次5 min，均于当日 8:00～12:00 am进行。实验时打开红外背景灯，明室灯光照度为400 lux，暗室照度为2 lux，速度阈值设置为18 cm/s。实验中 A 组关闭明室白光灯，B 组则开启明室白光灯，所有动物均背朝通道放入明室，计算机软件记录动物在明室和暗室运动时间、运动路程等基本活动情况。动物来源同1.4.1。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 明暗环境的验证

动物从明室放入，检测5 min，实验结果表明:同明室无灯组相比，明室有灯组的穿箱次数显著减少(P< 0.05)、明室有灯组的明室时间显著减少(P< 0.01)、暗室时间显著增加(P< 0.05)，且暗室时间为总时间的79.4%。结果如表1所示。

表1 明暗环境验证结果Tab.1 Results of the environment check

注：与明室无灯组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the lit area without light group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表2 大鼠明暗箱图像分析处理系统人工记录与计算机记录的运动时间相关性Tab.2 Correlation of movement time of the rats collected by the computer and manual recording system in the light/dark test

注：与人工记录的数据相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the manual record，*P< 0.05，**P< 0.01.

2.2 运动阈值的确认

运动阈值为 9、18、27、36、45、54 cm/s 时，人工计时与明暗箱测试软件的Pearson相关系数见表2。当运动阈值为18 cm/s时，人机相关系数最高，为0. 996，差异有显著性。之后进行了多批次的实验验证，结果类似，证明明暗箱图像分析处理系统准确、客观的反映了动物在明暗箱中的活动情况。如表2所示。

2.3 指标可靠性验证

如表3所示，穿箱次数的人机相关性系数是0.998(P< 0.01)、明室时间的人机相关性系数是0.998(P< 0.01)、暗室时间的人机相关性系数是0.994(P< 0.01)、入明次数的人机相关性系数是0.997(P< 0.01)、入明潜伏期的人机相关性系数是0.998(P< 0.01),差异均有显著性，与人工记录值高度相关。结果见表3。

2.4 明暗箱图像分析处理系统的应用

如表4所示，模型组(明室有灯组)、正常组(明室无灯组)两组的运动时间、明(暗)室的平均速度差异均无显著性，模型组的自主活动未受到影响。与正常组，模型组的穿箱次数(P< 0.01)、明室时间(P< 0.01)、明室运动总时间(P< 0.01)、明室运动路程(P< 0.01)显著减少；入明潜伏期(P< 0.01)、暗室运动时间(P< 0.01)、暗室运动路程(P< 0.01)度显著增加。同时轨迹热点图也可生动形象的表明此结果。结果见表4、图5。

表3 大鼠明暗箱图像分析处理系统各指标相关性分析Tab.3 Correlation of basic indexes of the computer-aided-controlling and image analysis system for light/dark box test of the rats

注：与人工记录的数据相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the manual record，*P< 0.05，**P< 0.01.

表4 两组大鼠在明暗箱实验中各指标的比较Tab.4 Comparison of the indexes of the light/dark box text in the two rat groups

注：与正常组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.05，**P< 0.01.

注：(A)空白组；(B)模型组。图5 大鼠的明暗箱图像分析处理系统轨迹热点图Note.(A)Control group.(B)Model group.Fig.5 Trajectory diagram and hot spot map of the computer-auto-controlling and analysis system for light/dark box test of the rats

3 讨论

明暗箱是抗焦虑药物筛选以及焦虑症病理机制研究中评价啮齿类动物的经典实验方法[13-14]。结合医学实验动物学、计算机科学、机械工程学等多学科优势，利用计算机视频采集技术和图像分析技术，提供了一种自动化程度高、重复性好、提取信息量大、指标敏感性强、图形信息形象而生动的大、小鼠明暗箱图像分析处理系统。

安静、稳定的实验环境是行为学实验结果可靠的先决条件。明暗箱图像分析处理系统采用封闭的箱体，红外灯作为背景光源，白炽灯作为明室光源，模拟了自然环境，又对实验环境进行了严格的控制。经过多批次的实验研究表明，暗室时间大于总时间的70%，表明明暗环境成立，此结果也与文献报导相一致[5]。明暗箱图像分析处理系统利用图像处理、数据挖掘等技术提取约26项指标。评价指标体系从时间、位置、速度和路程等几个方面全面而系统的提取动物的活动信息。对实验系统所提取的指标进行人机相关性验证，是仪器研发最重要和最基本的工作[15-19]。经过大量的实验研究表明，当运动阈值为 18 cm/s 时，计算机与人工获取的运动时间高度吻合，人机相关系数达r>0.99。同时穿箱次数、明室时间、暗室时间、入明时潜伏期的人机相关系数r>0.99，计算机所采集的数据客观、可靠。 实验室将采用不同品系的大鼠和小鼠、不同的动物模型对明暗箱实验系统所提取出的大量行为学指标进行进一步研究，以期建立更加准确的指标评价体系。

明暗箱实验是经典的焦虑动物模型[6,20-22]。穿箱次数、明室时间、入明潜伏期等是明暗箱实验中评价动物状态的重要指标参数[11,24-25]。用明暗箱模型组与正常组大鼠进行比较，结果表明，同正常组相比，运动时间、明(暗)室的平均速度无显著性差异。穿箱次数、明室时间、明室运动总时间、明室运动路程显著减少。入明潜伏期、暗室运动时间、暗室运动路程度显著增加。同时系统实时提取的视频图像、轨迹图以及热点图等图像信息也丰富生动的了描述了动物的焦虑状态和自主活动状态。因此本系统的所获的这些指标与经典明暗箱模型的特点高度吻合[14]。

综上所述，该明暗箱图像分析处理系统为动物行为学研究提供了一套自动化程度高、获取信息量大、人机数据高度相关、指标客观灵敏的分析处理系统，可推广用于抗焦虑药物的筛选以及焦虑症病理机制的研究。

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