双芳基酮还原酶的基因挖掘及催化性质

唐铭烩 ， 许国超 ， 倪 晔 *

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

（R）-（4’-氯苯基）-（吡啶-2’-基）-甲醇[（R）-（4’-chlorophenyl） （pyridin-2’-yl）methanol， （R）-CPMA，C12H10ClNO]是一类重要的手性双芳基甲醇，可作为关键手性中间体用于合成治疗梅尼埃综合症、血管性头痛、脑动脉硬化及急性缺血性脑血管等疾病的药物，如抗组胺药倍他司汀。鉴于手性（R）-CPMA和双芳基甲醇广泛的应用价值，其高效、绿色地合成具有非常重要的意义。目前手性双芳基甲醇的合成方法主要有对映选择性拆分法、亲和加成法和生物不对称还原法，而由于生物不对称还原法具有100%的理论得率、操作简便、反应条件温和等特点被认为是最具应用潜力的合成方法之一[1-3]。

Corey EJ 等[4]发现 CBS（Corey-Bakshi-Shibata）还原剂可用于双芳基甲酮底物的不对称还原，生成手性双芳基甲醇，该法是目前为止具有最高对映选择性的化学还原法。在-40℃条件下，手性硼杂恶唑烷（CBS催化剂）和儿茶酚硼烷的甲苯溶液可还原1-（4’-氯苯基）-（吡啶-2’-基）-甲酮（CPMK）生成（R）-CPMA，最终反应转化率为78%，ee值为98%。但该方法的反应温度条件苛刻，对底物的要求高，才会具有高选择性，因此适用范围非常有限[1]。2007年，Truppo MD等筛选了一系列商品化酮还原酶KRED后，发现虽然有一些KRED对双芳基酮底物有还原能力，但立体选择性一般，仅KRED124可以不对称还原10 g/L的CPMK生成（R）-CPMA，ee值为94%，转化率98%[5]；2009年，Zhu DM等发现来源于Sporobolomyces salmonicolor的重组羰基还原酶SSCR及其突变体可以立体选择性还原不同双芳基酮底物 （8-99%ee）[6-7]，在葡萄糖脱氢酶的协助下，可还原 1-（4’-氯苯基）-1-苯基甲酮生成 1-（4’-氯苯基）-1-苯基甲醇，转化率为62%，对映选择性为 88%（R）；2012年，本研究室周婕妤等[8-9]通过传统富集培养筛选到一株克鲁维酵母Kluyveromycessp.CCTCCM2011385，可催化还原 CPMK 生成（S）-CPMA（87%ee），然而野生菌全细胞最高仅能催化2 g/L CPMK的转化反应。

作者采用基因组数据挖掘的策略，克隆了9个不同来源的假定双芳基酮还原酶。经功能筛选发现来源于克鲁维多孢酵母Kluyveromyces polysporus的羰基还原酶KpADH对CPMK具有最高的催化活性和对映选择性，且该酶可用异丙醇为辅底物实现自身底物偶联型辅因子循环。为了更好的应用KpADH，作者对重组KpADH进行纯化，研究了该酶的最适温度、最适pH、金属离子依赖性、有机溶剂耐受性、底物特异性和酶动力学参数等酶学性质，并考察了重组菌在生物催化CPMK不对称还原上的效果，对进一步利用双芳基酮还原酶KpADH合成手性双芳基仲醇具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 本研究所用到的菌株和质粒见表1。

表1 本研究所用到的菌株及载体Table 1 Lists of microorganism strains and vectors used in the study

1.1.2 引物 本研究用到的引物见表2。

1.1.3 培养基 LB培养基（g/L）：酵母提取物5；胰蛋白胨10，氯化钠10；pH 7.0，121℃灭菌20 min。固体培养基则添加2 g/dL的琼脂。

表2 基因挖掘实验所用引物Table 2 Primers used in genome mining.

1.1.4 试剂 T4 DNA连接酶、限制性内切酶NdeI、BamH I、prime star DNA 聚 合 酶 、protein molecular marker：购于大连宝生物；2×Taq DNA 聚合酶：购于杭州宝赛生物工程有限公司；DNA marker、质粒及基因组提取试剂盒、胶回收及PCR产物纯化试剂盒：购于上海捷瑞生物工程有限公司；NADPH及NADP+：购于Roche；发酵培养基各种成分：购自国药集团药业股份有限公司；IPTG、卡那霉素：购于生工生物（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因序列的扩增 按照酵母及细菌基因组DNA抽取试剂盒（上海生工生物有限公司）说明书提取各菌株的基因组，并以此为模板，添加表1所示引物进行PCR扩增，反应体系为：dNTP mix 4 μL，5× prime star buffer 10 μL，引物 1（10 μmol/L）1 μL， 引物 2 （10 μmol/L） 1 μL， 模板 10～50 ng，DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 补足到 50 μL。 PCR的扩增程序为：95℃预变性2 min，95℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min 10 s，循环25次，72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.2 重组质粒的构建与大肠杆菌基因工程菌的构建 目的基因与表达载体pET-28a同时进行双酶切。酶切体系为：目的基因/质粒1 000 ng，10×K buffer 10 μL，Nde I（10 U/L） 2 μL，BamHI（10 U/L）2 μL，ddH2O 补足到 100 μL。 将上述反应液混合均匀，于37°C酶切完全。参照核酸胶回收试剂盒说明书回收酶切后的目的基因和pET28a，然后用T4连接酶连接，连接体系为：T4连接酶 （5 U/L）1 μL，10×Ligation buffer 1 μL，线性化 pET28a 50 ng，目的基因 100 ng，ddH2O补足到20 μL。反应液混合均匀，16℃连接10 h。将连接产物转入感受态E.coli BL21（DE3）中，将后培养液均匀涂布于含有卡那霉素的固体平板上，于37℃倒置培养12 h，挑取单菌落进行菌落PCR验证，选择阳性克隆进行培养及测序验证。

1.2.3 培养条件、粗酶液的制备、蛋白质纯化及酶活测定 将上述菌种接种至30 mL培养基中，于37℃，180 r/min振荡培养，待OD600达0.6时加入30 μL IPTG诱导（IPTG浓度为100 mmol/L），于 30℃继续振荡培养5 h。在4℃和8 000 g条件下离心5 min，倒掉上清液，向菌体中加入10 mL的磷酸钾缓冲液（100 mmol/L，pH 7.0），使用超声波破碎仪破碎细胞（功率 285 W，工作 1 s，间歇 3 s，10 min）。 取其中1 mL进行12 000 r/min离心5 min，取上清液（粗酶液）进行酶活测定。重组KpADH蛋白的纯化方法参见前期报道[10-11]。

还原活力测定方法：总反应体系为200μL，包括 0.5 mmol/L NAD（P）H，0.5 mmol/L CPMK，磷酸钾缓冲液（KPB，100 mmol/L，pH 5.5），充分混匀，30 ℃保温2 min，加入10 μL合适浓度的酶液，检测340 nm下吸收值的变化。酶活力单位（U）定义为：在上述条件下，每分钟催化氧化 1 μmol NAD（P）H 所需要的酶量。

氧化活力测定方法：总反应体系为200μL，包括 5 mmol/L NAD（P）+，10 mmol/L 异丙醇，磷酸钾缓冲液（KPB，100 mmol/L，pH 10.0），充分混匀，30 ℃保温2 min，加入10 μL合适浓度的酶液，检测340 nm下吸收值的变化。酶活力单位（U）定义为：在上述条件下，每分钟催化还原 1 μmol NAD（P）+所需要的酶量。

其中，EW为1 min内340 nm处吸光值的变化；V为反应液的总体积 （mL）；6 220为摩尔消光系数（L／（mol·cm））；l为光程距离（cm）。

蛋白质含量测定采用Bradford法，以小牛血清白蛋白BSA为标准品[12]。

酶比活力计算公式：

1.2.4 全细胞水相催化及检测 将30 mL诱导后的重组菌E.coli BL21/pET28a-kpadh（OD600约为5），充分重悬于 9.5 mL磷酸钠缓冲液 PBS（100 mmol/L，pH 8.0），于 20 mL的反应器中加入 100 mmol/L 的 NADP+10 μL，500 mmol/L 的 CPMK （溶解于异丙醇）500 μL，总体系为10 mL。将上述反应体系置于30℃，180 r/min振荡反应直至反应结束。每隔一段时间取样 100 μL， 加入 400 μL PBS（100 mmol/L，pH 8.0）缓冲液和 500 μL 乙酸乙酯萃取，取出上层有机相，待有机相自然挥发完全，加入500 μL HPLC级的乙醇，进行正相HPLC检测。

通过正相HPLC分析CPMK转化率和 （R）-CPMA的对映选择性，具体方法为：Agilent 1100 HPLC（美国），Chiralcel OB-H（0.46 mm×250 mm×5 μm）色谱柱，流动相为含有0.1%乙醇胺的正己烷∶乙醇（体积比 95∶5），流速 1.0 mL/min，254 nm，柱温30 ℃，（S）-和 （R）-CPMA 的保留时间分别为 8.2、9.0 min。ee值计算公式：

式中，AR为（R）-CPMA 的峰面积；AS为（S）-CPMA的峰面积。

2 结果与讨论

2.1 基因挖掘、重组菌株的构建及筛选

来源于近平滑假丝酵母 （Candida parapsilosis）的醇脱氢酶CpSADH，具有广泛的底物谱，可以催化多种潜手性羰基化合物的不对称还原，可还原76.6 g/L 的 1，3-丁二酮为（R）-1，3 丁二醇（95%ee）[13-14]，对苯乙酮、丁酮和酮酯等底物也有很高的还原活力，因此我们推测其底物结构口袋较大，可以容纳双芳基酮类底物。更重要的是CpSADH具有底物偶联辅因子再生的活性，可利用异丙醇为辅底物实现NADPH的原位再生[14]。具备底物偶联的辅因子再生的羰基还原酶可单独实现不对称还原反应的进行和辅因子再生，无需外源辅因子再生系统如葡萄糖脱氢酶等的协助，避免了双酶的比例不匹配等不足，降低催化剂的制备成本，受到生物还原法的青睐。在酶的基因挖掘中，序列相似性在30%～70%的基因通常既保留了一部分与探针酶相似的功能，又具有一定的特异性。因此本研究选用CpSADH作为基因挖掘的探针酶，将其蛋白质序列在NCBI数据库中比对后选取9个未经报道且与探针序列相似性为34%～65%的基因进行表达和筛选，见表3。

按照方法1.2.1和1.2.2成功将9个基因从基因组上进行扩增，并连接到表达载体pET28a，将重组载体热转入E.coli BL21（DE3），成功构建重组菌。按照方法1.2.3对重组菌进行摇瓶培养，诱导产酶，并结合SDS-PAGE分析和酶活力分析对假定羰基还原酶进行功能筛选。仅有来源于K.polysporus的CR1可以检测到对CPMK有明显的还原活力（1.4 U/mg），并且CR1还可氧化异丙醇 （0.40 U/mg）。因此CR1是一个具有底物偶联辅因子再生能力的双芳基酮还原酶，并将其命名为KpADH，其编码基因为kpadh。为了进一步拓展其在手性双芳基醇合成中的应用，作者对其进行分离纯化，研究了KpADH的酶学性质及不对称还原反应效果。

2.2 KpADH的蛋白质序列分析

羰基还原酶的分类有很多，按催化功能及空间结构的差异可以分为3大类：醛还原酶（AKR）、短链脱氢酶（SDR）及中链醇脱氢酶[15]。SDR是氧化还原酶中具有多样性功能的一类酶，其蛋白质结构中一般包含保守N端、参与NAD（P）（H）识别和结合的Rossmann折叠、底物结合结构域和非保守的C端。Extended SDR和Classical SDR是SDRs家族中最重要的两个亚家族，Extended SDRs家族的酶有共同的辅因子结合区域及结合序列，即位于N端的[S/T]GXXGXX[G/A]（X代表任意的一种氨基酸）序列，除此之外还有保守的催化基序YXXXK。将KpADH的氨基酸序列在NCBI数据库中比对显示，KpADH属于Extended SDR亚家族。从数据库中选取了KpADH的同源酶，并进行多序列比对，结果见图1。可以看出，KpADH虽然与这些酶在一级序列上具有一定的差异性，但二级结构很保守，且具有保守的辅因子识别区和催化三联体，如Ser126，Tyr165和Lys169（红色三角形标识）。综上，KpADH与已知醇脱氢酶CpSADH的序列一致性仅为38%，且未曾有关于该酶催化功能的研究报道，该酶属于短链脱氢酶家族的新成员。

表3 基因数据挖掘中所选取的假定羰基还原酶Table 3 Putative carbonyl reductases selected from NCBI database using genome mining

图1 KpADH与来源于Extended SDRs家族蛋白质的氨基酸序列比对Fig.1 Sequence alignment of KpADH to other carbonyl reductase sequences

2.3 KpADH的纯化

为了研究KpADH的酶学性质，对重组KpADH依次进行镍柱纯化、脱盐和浓缩处理，最终得到0.5 mg/mL的纯酶。对粗酶、穿透峰蛋白和纯酶进行SDS-PAGE分析，见图2。KpADH纯酶仅有一条带，纯酶纯度达到电泳纯，活力回收率约为45.5%。根据SDS-PAGE图计算可知，KpADH单亚基的相对分子质量约为45 000，与理论相对分子质量大小相符。纯酶的比还原活力8.9 U/mg，粗酶的比还原活力为1.4 U/mg，纯化倍数为6倍。辅因子依赖性测定显示，KpADH既可以依赖于NADPH也可依赖于NADH，且在NADPH存在下KpADH的活力约为NADH的5倍。

图2 纯化KpADH的SDS-PAGE电泳图谱Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified KpADH

2.4 KpADH的动力学参数的测定

Km是酶的一个特征性常数，Km的大小只与酶的性质有关，Km越小亲和力越大，kcat越大催化效率越高，为了研究该酶对底物的亲和力和催化效率，作者测定KpADH在不同底物浓度和辅酶浓度情况下的酶活，并得到了很好的线性拟合，见图3。计算得到KpADH的动力学参数，见表4。

由表4可知，该酶对CPMK的亲和力（Km=0.50 mmol/L）高于对异丙醇的亲和力（Km=6.36 mmol/L），且还原CPMK的速率（kcat=64.67 s-1）高于氧化异丙醇的速率（kcat=55.27 s-1），因此KpADH对CPMK的底物专一性常数 kcat/Km（129.33 L/（s·mmol））高于异丙醇（8.69 L/（s·mmol））。 由此可知该酶更倾向于发挥还原CPMK的功能，有利于还原反应朝 （R）-CPMA合成的方向进行。该酶对辅酶NADPH的kcat，kcat/Km均高于NADP+，说明该酶更倾向于氧化NADPH，这也符合该酶倾向于还原CPMK的结果。

图3 KpADH的动力学参数Fig.3 Kinetic parameters of KpADH

表4 KpADH的动力学参数Table 4 Kinetic parameters of purified KpADH

2.5 pH对KpADH催化活性的影响

缓冲液的pH会通过改变活性中心的微环境来影响酶的催化活性，本研究测定在不同的pH缓冲液中（柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0～6.0）、磷酸钠缓冲液（pH 6.0～8.0）、 甘氨酸-NaOH 缓冲液 （pH 8.0～12.0））KpADH的氧化和还原活力的高低，结果见图4。对于KpADH的还原活力，其最适pH 5.5，当pH＜5.5时活力迅速下降，当pH＞5.5时下降缓慢，且在碱性范围内KpADH仍保留有一定的催化活力，如在pH 8.0时，相对活力约为58%。对于KpADH的氧化活力，其最适pH为9.5，当pH＜9.5时，活力迅速下降，在酸性范围内仅保留有约40%的催化活力，在pH 9.5～11.0时，KpADH的相对氧化活力＞80%。此外，在氧化反应的最适pH下，还原活力仅27%，而在还原反应的最适pH下，氧化活力仅5%。为了利用该酶的底物偶联辅因子再生的优势，需要同时具备较高的氧化和还原活力，才能实现辅因子原位再生和底物还原的目标。因此在生物催化过程中，需要对反应缓冲液的pH值进行优化，选择氧化和还原活力均较高的pH，以使得催化剂发挥最大的作用。

图4 pH对KpADH酶活力的影响Fig.4 Effect of pH on the activity of purified KpADH

2.6 金属离子及添加剂对KpADH活力的影响

据报道，少数SDR家族的羰基还原酶具有金属离子依赖性，如二价金属离子Mg2+可通过作用于酶的活性中心或底物结合位点而影响酶的活力。作者考察了不同金属离子对羰基还原酶KpADH活力的影响，以不添加金属离子所测得的酶活力为对照（100%），结果见表5。没有发现具有显著激活KpADH的氧化和还原活力的金属离子。Mg2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Li+等离子对 KpADH 的还原和氧化活力的有轻微的激活作用，相对还原和氧化活力分别约为 110%和 120%；Zn2+、Al3+、Cu2+、Ag2+、Fe2+等离子对KpADH的氧化和还原活力都具有严重的抑制作用，推测可能是因为 Zn2+、Al3+、Cu2+、Ag2+、Fe2+与参与催化的氨基酸残基结合从而导致了酶的活力下降。EDTA的添加并没有使酶活力降低，从另一方面说明KpADH不是金属离子依赖性酶。蛋白质变性剂SDS的添加导致酶解聚成单体，而单体仅保留有8%的相对活力，说明KpADH的活性依赖于多聚体。吐温20、DTT、β-巯基乙醇的添加可在一定程度上促进KpADH的氧化和还原活力。其中，吐温20使酶活力增加最多，可能由于吐温20作为分散剂增加了难溶底物CPMK在水中的溶解度，从而增大了酶与底物的接触机率；另外DTT与β-巯基乙醇是还原剂，二者的添加可以防止二硫键之间的交联，这可能是二者添加使得酶活力增大的原因。

表5 金属离子及添加剂对KpADH的还原酶和氧化酶活力的影响Table 5 Effects of metal ions and additives on the reducing and oxidizing activities of KpADH

2.7 有机溶剂对KpADH活力的影响

生物催化反应的底物大部分都是不溶于水或难溶于水的，在催化反应中需要添加助溶剂，以增加酶与底物接触的机会，降低传质阻力。生物催化反应要求助溶剂具有较好的生物相容性、对酶的毒性小、对底物的溶解性高。因此考察了常用有机溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、丙酮对酶活力的影响，CPMK在这5种有机溶剂中的溶解度能达到500 mmol/L，而且甲醇、乙醇和异丙醇也可作为催化反应的辅底物。由图5（a）可知，对于KpADH的还原活力，在体积分数0.5%的5种溶剂中，酶活力都明显高于空白对照，而在体积分数1%时，酶活力开始降低，当体积分数大于3%时，酶活力快速降低。由此可见，低体积分数的有机溶剂可以使CPMK更好的分散，从而可以促进酶活力，而随着有机溶剂体积分数逐渐增加到一定程度，其毒性逐渐增强，酶活力显著降低。另外，在低体积分数有机溶剂条件下，甲醇是很好的助溶剂，而在稍高的体积分数（如3%）时乙醇则是最好的助溶剂。异丙醇可作为KpADH的辅底物，适量的异丙醇即可促进底物溶解，提高KpADH的催化活力，异丙醇达20%时，KpADH仍保留30%的相对活力，可见KpADH具有良好的异丙醇耐受性。由图5（a）可知，表观上丙酮对KpADH没有毒性，20%的丙酮存在下KpADH仍保留117%的相对活力，这是由于丙酮自身也可作为KpADH的底物而被还原，因此丙酮对KpADH的影响要从氧化活力的变化来判断。

由图5（b）可知，随着乙醇、甲醇、四氢呋喃、丙酮的体积分数增高，酶氧化活力急剧降低，由此可见有机溶剂对KpADH氧化功能的毒性大于还原功能，尤其是四氢呋喃，仅0.5%即可抑制90%的氧化活力。丙酮作为异丙醇氧化的产物，对KpADH活力的影响同样非常显著，当丙酮体积分数大于5%时，氧化活力降低至20%。综上，异丙醇可以作为该生物还原反应优选的助溶剂和辅底物，然而其辅产物丙酮对酶活力存在一定的影响，移除高体积分数的丙酮可以降低抑制作用，促进生物还原反应朝手性双芳基醇合成的方向进行。

图5 有机溶剂对KpADH的还原和氧化活力的影响Fig.5 Effect of organic solvents on the reducing and oxidizingactivities of KpADH

2.8 KpADH的底物特异性

为了研究KpADH不对称还原多种潜手性酮的能力，拓展KpADH的应用范围，对其底物特异性进行考查。选取一系列不同酮类（芳基酮、双芳基酮、酮酯和烷基二酮）和醇类底物，考察KpADH对这些底物的氧化和还原活力，结果见表6。对于芳基酮类底物，KpADH对CPMK和苯乙酮均表现出较高的还原活力（100%和56.4%），这类底物位阻大，在水中溶解度低，与羰基还原酶的天然底物性质相差较大，对此类底物有高的催化活性的酶较少。对比二苯甲酮，苄基苯乙酮和3，4-二氯二苯甲酮发现，随着空间位阻的进一步增大，KpADH的催化活性逐渐降低。 对于 2，3-戊二酮、2，4-戊二酮、2，3-己二酮、3，4-己二酮和 2，5-己二酮等二酮类底物，KpADH更易于还原2，4-戊二酮（74.6%相对活力）。KpADH对酮酯类底物的活力较高，对2-氧-4-苯基丁酸乙酯和乙酰乙酸乙酯的还原活力可以达到CPMK的24倍左右。对于氧化反应的底物特异性，除了2，3-丁二醇外，相对活力均小于10%。KpADH氧化2，3-丁二醇的活力是氧化异丙醇活力的3.6倍，表明2，3-丁二醇可作为用于辅因子再生的潜在辅底物。

表6 KpADH的底物特异性Table 6 Substrate specificity of KpADH towards various prochiral ketones

2.9 利用KpADH不对称还原制备（R）-CPMA

由于KpADH的氧化和还原活力的最适pH有所差异，合适的反应缓冲液对于KpADH催化的生物还原反应非常重要。因此考察利用KpADH在不同pH（pH 7.0，8.0和9.0）条件下催化反应的效果。反应相同时间后，终止反应，液相色谱分析发现KpADH在pH 8.0的缓冲液中转化率最高（＞99%），此时KpADH的相对还原活力和氧化活力分别为初始活力的43%和72%。所以选择pH 8.0的缓冲液研究重组菌全细胞催化还原CPMK。

进一步研究KpADH在制备双芳基甲醇中的效果。在10 mL反应体系中，利用重组菌E.coli BL21/pET28a-kpadh全细胞对100 mmol/L的CPMK进行不对称还原，反应进程见图6。在10 h内，CPMK转化率达到99.8%，经分离纯化后产物（R）-CPMA的摩尔得率为88.7%，ee值为82%。据报道[16]，利用来源于Kluyveromyces marxianus的羰基还原酶KmCR催化还原50 mmol/L CPMK，反应12 h后，转化率不到20%，产物（R）-CPMA的ee值仅为23.4%；利用来源于毕赤酵母GS115的羰基还原酶PasCR催化还原一系列二芳香基甲酮类化合物（10 mmol/L），转化率最高仅为90%，且ee值较低[17]。尽管双芳基甲酮类底物的位阻较大，KpADH仍然表现出较高的催化活性，为手性催化合成（R）-CPMA奠定了重要基础。

图6 重组菌E.coli BL21/pET28a-kpadh水相中不对称催化还原CPMK的反应进程曲线Fig.6 Time course of asymmetric reduction of CPMK by E.coli BL21/pET28a-kpadh in aqueous system

3 结 语

采用基因组数据挖掘的策略，从Kluyveromyces polysporus中发现了具有还原双芳基酮活力的醇脱氢酶KpADH基因，并成功地在大肠杆菌中实现可溶性表达。KpADH属于短链脱氢酶家族，具有保守的催化三联体和辅酶结合域。KpADH可利用异丙醇为辅底物，原位再生辅酶NADPH。底物特异性研究发现，KpADH对酮酯类底物和2，3-丁二醇有更高的活力，分别是对CPMK和异丙醇活力的24倍和3.6倍左右。动力学参数研究表明，该酶更适合发挥其还原功能。KpADH氧化活力的最适pH 9.5，还原活力的最适pH 5.5，全细胞催化反应的最适pH 8.0。在水相中能够不对称催化还原100 mmol/L CPMK，转化率达到99.8%，摩尔得率为88.7%，产物（R）-CPMA的ee值达到82%，是迄今为止不对称还原双芳基酮类底物效果较出色的一种新酶。本研究对高效制备光学纯CPMA具有一定的指导意义，为进一步利用其合成光学纯手性双芳基醇，我们正在开展KpADH立体选择性的分子改造。

参考文献：

[1]SCHMIDT F，STEMMLER R T，RUDOLPH J，et al.Catalytic asymmetric approaches towards enantiomerically enriched diaryl methanols and diaryl methylamines[J].Chemical Society Reviews，2006，35：454-470.

[2]SUI Y Z，ZHANG X C，WU J W，et al.CuII-catalyzed asymmetric hydrosilylation of diaryl-and aryl heteroaryl ketones：application in the enantioselective synthesis of orphenadrine and neobenodine[J].Chemistry：A European Journal，2012，18：7486-7492.

[3]REAMER R A，CHILENSKI J R，McWilliams C J.Highly enantioselective hydrogenation of aromatic-heteroaromatic ketones[J].Organic Letters，2003，5：5039-5042.

[4]COREY E J，HELAL C J.Asymmetric synthesis of （S）-carbinoxamine.New aspects of oxazaborolidine-catalyzed enantioselective carbonyl reduction[J].Tetrahedron Letters，1996，37：5675-5678.

[5]TRUPPO M D，POLLARD D，DEVINE P.Enzyme-catalyzed enantioselective diaryl ketone reductions[J].Organic Letters，2007，9：335-338.

[6]ZHU D M，YANG Y，MAJKOWICZ S.Inverting the enantioselectivity of a carbonyl reductase via substrate-enzyme dockingguided point mutation[J].Organic Letters，2008，10：525-528.

[7]LI H M，ZHU D M.Enantioselective reduction of diaryl ketones catalyzed by a carbonyl reductase fromSporobolomyces salmonicolorand its mutant enzymes[J].Advanced Synthesis&Catalysis，2009，351：583-588.

[8]NI Y，ZHOU J Y，SUN Z H.Production of a key chiral intermediate of Betahistine with a newly isolatedKluyveromycessp.in an aqueous two-phase system[J].Process Biochemistry，2012，47：1042-1048.

[9]周婕妤.克鲁维酵母不对称还原合成倍他司汀重要手性中间体的研究[D].无锡：江南大学，2013.

[10]INOUE H，NOJIMA H，OKAYAMA H.High efficiency transformation ofEscherichia coliwith plasmids[J].Gene，1990，96：23-28.

[11]许国超.芳基酮还原酶的发现、改造及其催化制备手性仲醇的研究[D].上海：华东理工大学，2013.

[12]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[13]YAMAMOTO H，MATSUYAMA A，KOBAYASHI Y.Synthesis of （R）-1，3-butanediol by enantioselective oxidation using whole recombinantEscherichia colicells expressing（S）-specific secondary alcohol dehydrogenase[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2002，66：925-927.

[14]YAMAMOTO H，MATSUYAMA A.Purification and characterization of （S）-1，3-butanediol dehydrogenase from Candidaparapsilosis[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1995，59：1769-1770.

[15]TIAN Laiqiang，LIU Weidong.Biochemical characterization and substrate profile of a highly enantioselective carbonyl reductase fromPichia pastoris[J].Chinese Journal of Biotechnology，2013，29：169-179.（in Chinese）

[16]LI H D，SUN Z H，NI Y.Novel stereoselective carbonyl reductase fromKluyveromyces marxianusfor chiral alcohols synthesis[J].Chemical Research in Chinese Universities，2013，29：1140-1148.

[17]LI Zhe，LIU Weidong，ZHU Dunming.Cloning and characterization of a novel carbonyl reductase for asymmetric reduction of bulky diaryl ketones[J].Chinese Journal of Biotechnology，2013，29：68-77.（in Chinese）