含醇发酵乳的研制

贾梦凡 ， 吕 欣

（1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119）

目前发酵乳多由嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌等乳酸菌发酵而成。近年来，随着人民生活水平的提高，人们对发酵乳的风味质地、新奇口感以及营养强化等方面有了更高的追求[1]。其中，开菲尔、酸马奶酒等引起了广泛关注[2]。酸马奶酒是一种以新鲜马乳为原料，自然发酵而成的具有一定保健功效，呈乳白色、均匀的含醇发酵乳饮料，其对心血管疾病、神经性疾病、消化系统疾病、糖尿病、肺结核及肺气肿等都具有一定治疗作用，并对某些癌症有防治作用[3-5]。但是马奶的季节性、来源少及低产量限制了酸马奶酒的产业化发展[6]。

作者以牛乳为原料，利用从新疆酸马奶中分离得到的乳酸菌及酵母菌混合发酵生产含醇发酵乳，优选乳酸菌和酵母菌并进行分子鉴定，进一步研究发酵温度、发酵时间、接种体积分数及接种比例等对发酵乳的影响，建立以牛乳为原料生产含醇发酵乳的最优工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸菌培养基（MRS）[7]；酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）[8]；脱脂牛乳：将脱脂牛乳粉溶于蒸馏水（1∶9）中搅拌均匀，加入5%白砂糖，在114℃条件下灭菌10 min后，迅速冷却待用。乳酸菌及酵母菌：分离自新疆酸马奶酒；白砂糖：市售一级；细菌基因组DNA提取试剂盒：OMEGA公司；酵母菌基因组DNA提取试剂盒：上海生物工程有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒：上海生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

722s可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司制造；Thermo Fisher高速冷冻离心机：美国热电公司；3420A气相色谱仪：北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司；PHS-3C精密pH计：上海日岛科学仪器有限公司；MJ Mini梯度PCR仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；JY04S-3C凝胶成像系统：北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌的筛选 将从酸马奶中分离出的9株乳酸菌冻干菌种分别接种于MRS液体培养基中，活化两代后保存于4℃MRS斜面待用。并取30 mL菌液于8 000 r/min离心3 min，倒去悬浮液，给沉在离心管底部的菌体加入20 mL生理盐水，悬浮，再离心2 min后，将沉淀菌体接种于灭菌脱脂乳中。于37℃发酵至凝乳，再接种至100 mL灭菌脱脂乳中，通过感官评定筛选乳酸菌菌株进行后续乳酸菌与酵母菌混合发酵试验研究。

1.3.2 酵母菌的筛选 将从酸马奶中分离出的14株酵母菌冻干菌种分别接种于YPD液体培养基中，活化两代后保存于4℃YPD斜面待用。并取30 mL菌液于8 000 r/min离心3 min，倒去悬浮液，给沉在离心管底部的菌体加入20 mL生理盐水，悬浮，再离心2 min后，将沉淀菌体接种于灭菌脱脂乳中。于28℃发酵至产生大量气泡，再接种至100 mL灭菌脱脂乳中，通过感官评定筛选酵母菌菌株用于后续乳酸菌与酵母菌混合发酵试验的研究。

1.3.3 菌株DNA的提取、扩增及分子鉴定 乳酸菌的提取按照OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒操作，扩增参照文献[9]操作；酵母菌的提取按照酵母菌基因组DNA提取试剂盒操作，扩增参照文献[10-11]操作。

将电泳回收产物用冰袋保存寄到生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测得乳酸菌菌株16S rDNA序列及酵母菌菌株26S rDNA序列后，在NCBI上进行BLAST比对。利用MEGA6.0软件绘制系统发育树。

1.3.4 单因素和正交试验 分别选取乳酸菌与酵母菌混合发酵温度为 26、28、30、32、34、36、38 ℃，混合发酵时间为 8、10、12、14、16、18、20 h， 接种比例（乳酸菌/酵母菌）为 2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，接种体积分数为 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；进行单因素发酵试验，选出对试验结果影响较大的指标参数进行正交试验，从而优化工艺参数，得到较优产品。

根据单因素试验结果设计因素水平表，做正交表进行正交试验，优化含醇发酵乳的工艺参数。试验因素与水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal design

1.3.5 分析方法 理化指标：pH用PHS-3C精密pH计测定[12]；滴定酸度用酸碱滴定法测定[13]；酒精度用气相色谱法测定[14]；总酸及氨基酸态氮按照奶酒国标GB/T 23546-2009方法测定[15]；持水力按照文献[16]的方法测定；还原糖质量浓度参照文献[17]的方法测定。

感官指标：本产品感官评定方法采用综合评分法，略有改动[18]。在有明亮的自然光、温度为25℃的房间内依据产品特点进行感官评定，感官评分标准（满分100分）见表2。

表2 含醇发酵乳感官评分表Table 2 Sensory evaluation of the fermented milk with low alcohol

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

2.1.1 乳酸菌 取活化两代后的9株乳酸菌MRS菌液30 mL，于8 000 r/min离心3 min，除去悬浮液后，给沉在离心管底部的菌体都加入20 mL生理盐水，再离心2 min，将9种菌体分别接种于灭菌脱脂乳中，再将脱脂乳放置于37℃发酵24 h后，进行感官评定，见表3。选择6号乳酸菌菌株进行后续试验。

表3 乳酸菌发酵性能试验结果Table 3 Results of lactic acid bacteria fermentation performance test

2.1.2 酵母菌 取活化两代后的14株酵母YPD菌液30 mL，于8 000 r/min离心3 min，除去悬浮液后，给沉在离心管底部的菌体都加入20 mL生理盐水，再离心2 min，将14种菌体分别接种于灭菌脱脂乳中，再将脱脂乳放置于28℃发酵24 h后，进行感官评定，见表4。

表4 酵母菌发酵性能试验结果（脱脂乳中不含蔗糖）Table 4 Results of yeast fermentation performance test（no sucrose in the skim milk）

7号、9号、12号气泡产生量适中，刹口感适中且品尝时具有发酵产生的特殊风味，选择7、9及12号酵母菌菌株进行下一步试验。

对选出的酵母菌再进行试验，观察它们在含5%蔗糖脱脂乳中的发酵情况并进行品尝和记录，见表5。

表5 酵母菌发酵性能试验结果（脱脂乳中含5%蔗糖）Table 5 Results of yeast fermentation performance test（5%sucrose in the skim milk）

7号气泡产生量适中，有轻微刹口感且发酵风味浓郁，而9号、12号产生大量气泡且有凝乳现象，摇动产生渣状沉淀，刹口感过于强烈，使人有不适感，故选择7号酵母菌菌株进行后续试验。

2.1.3 菌株分子鉴定结果 优选出的乳酸菌分子鉴定结果为Lactobacillus crustorum，酵母菌为Trichosporon asahii。

对于面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）及阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii），目前多数研究报道只是将其从一些原料中分离鉴定出来，如面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）曾在酸面团中分离得到[19-20]；席琳乔等[21]发现青贮复合系主要由4种微生物组成，其中包括Lactobacillus crustorum；董小婉[22]等在新疆哈萨克族酸奶中也分离得到过Lactobacillus crustorum；王薇等[23]首次从清香型白酒酿造过程中分离获得Trichosporon asahii，是对中国清香型白酒酿造酵母资源的补充；苏俊等[24]从山西偏关县的酸性稷米汁中分离出Trichosporon asahii，发现其有广阔的pH耐受性。但是，关于菌株发酵条件等的研究报道很少，我们将Lactobacillus crustorum与Trichosporon asahii在牛乳中共发酵得到优化的含醇发酵乳，对菌种的发酵条件等作了初步探究，见图1-2。

图1 乳酸菌基于16S rDNA的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of the lactic acid bacterium according to 16S rDNA sequences

图2 酵母菌基于26S rDNA的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the yeast according to 26S rDNA sequences

2.2 正交试验结果与讨论

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验确定含醇发酵乳最佳生产工艺，优化发酵条件，结果见表6。

由表6可知，影响含醇发酵乳质量的因素主次顺序为D﹥B﹥A﹥C，即接种比例﹥发酵时间﹥发酵温度﹥接种体积分数。因此本试验条件下确定的含醇发酵乳的最佳发酵条件组合为A3B1C1D3，即发酵温度为37℃，发酵时间为14 h，接种体积分数为4%，接种比例（乳酸菌/酵母菌）为 2∶3。 闫彬等[25]研究初步确定了双菌混合发酵的最佳培养条件，但其采用两阶段发酵，发酵工艺较为复杂，我们尝试在发酵过程中同时加入乳酸菌与酵母菌静置培养，使其自然发酵，所得优化工艺参数与马荣山等[26]的研究结果相近。

表6 含醇发酵乳发酵工艺L9（34）正交试验结果Table 6 Results of orthogonal experiments about optimization fermentation conditions of the fermented milk with low alcohol

2.3 含醇发酵乳产品理化指标

按照最优工艺参数进行发酵，所得含醇发酵乳的理化指标见表7。

与马荣山[26]等比较，总酸质量浓度相近，酒精度较低，与黄翠姬[27]等比较，滴定酸度及酒精度偏低，与张和平[28]等比较，酒精度相近，氨基酸态氮质量浓度高。由于试验方法及所用菌种的不同，所得产品理化指标的测定结果存在差异。

表7 含醇发酵乳理化指标测定结果Table 7 Results of physical and chemical indexes

3 结语

作者以牛乳为原料，利用分离自新疆酸马奶中的乳酸菌及酵母菌，从中优选出一株乳酸菌及一株酵母菌并进行分子鉴定，乳酸菌为Lactobacillus crustorum，酵母菌为Trichosporon asahii，通过单因素及正交试验优化含醇发酵乳的生产工艺，优化的工艺参数为：发酵温度37℃，发酵时间14 h，接种体积分数 4%，接种比例（乳酸菌/酵母菌）2∶3，在该条件下测定了含醇发酵乳成品的理化指标。本研究所用菌株均分离自新疆酸马奶，并将乳酸菌与酵母菌同时发酵，产品风味独特，与酸马奶接近，且生产工艺较简单，易于工业化生产，具实用性。因此，本研究为含醇发酵乳的开发及产业化提供了一定理论依据。

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