蜘蛛粉中糖胺聚糖提取工艺的优化

桑 晓，韩海燕，王彦多，刘 颖，曹广超，王 静，黄志强，方 园，毛会秀，王集会

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南 250355；3.东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

蜘蛛又名网虫、园蛛、扁蛛、盘丝仙，是蜘蛛目所有种的统称[1]。据相关期刊报道，目前全球确定的蜘蛛种类大约有4万种，其中在中国已经确定的大约4000种[2]。蜘蛛分布较广，适应性较强，大多数的蜘蛛具有毒腺，蜘蛛毒素能有效杀死癌细胞。据文献资料显示，蜘蛛具有较高的药用价值。据《雷公炮炙论》记载，蜘蛛去除头、足，然后研如膏，便可和其他中药材一起治疗疾病。传统中医认为，蜘蛛性甘、微苦、微寒、有毒、归肝经，具有祛风、消肿、解毒、消肿瘤、散结等效用。现今蜘蛛作为药材使用，主要治疗毒虫咬伤，肾阳亏损，中风口斜、鼻炎、脱肛、肺结核[5]等症。

糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)又被称为黏多糖[6],因其溶解度多具有较高粘度而得名[7]，是普遍存在于动物体内，植物中也有发现的复合多糖[8-10]。糖胺聚糖分子中含有糖醛基和氨基糖残基[11-12]，并由于糖胺聚糖含羧基比例较高，且多含硫酸基，具有较强的酸性，也称酸性黏多糖[13]。糖胺聚糖具有多种药理作用，能促进伤口愈合，能提高机体免疫能力，而且多数不具有毒副作用，是比较理想的药物成分[14-15]。糖胺聚糖具有抗凝血、抗血栓、降血脂、抗炎症、抗病毒、抗肿瘤[16]、抗衰老、预防骨质疏松等药用价值，在生物药物新药研发中日益受到人们的青睐[17-18]。

本实验采用紫外可见分光光度法,以蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取量为指标[18]，以料液比、提取温度、提取时间为试验因素[19-21]，通过三因素三水平的正交实验来探讨糖胺聚糖的最佳提取工艺。

1 实验材料

1.1 仪器设备

UV9100B紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；康世洁PL-S20小型超声波清洗机(东莞康世洁超声波科技有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；FA1004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；HWI电热恒温水温箱(北京医疗设备厂)；远红外辐射干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)；雷磁PHS-25 数显pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.2 实验试剂

硫酸软骨素对照品(北京索莱宝科技有限公司,批号：9007-28-7)，氢氧化钠，胰蛋白酶，硫酸，无水乙醇，磷酸，石油醚，等试剂均为分析纯。

1.3 供试品

蜘蛛粉(从河北安国中药材市场购买，由山东中医药大学药学院高德民副教授鉴定为圆蛛科圆网蛛属大腹园蛛Arunea ventricosa(L.Koch))。

2 试验方法

2.1 阿利新蓝溶液的制备

精密称取0.1100 g阿利新蓝8GX，加入到0.15 g·mL-1H3PO4-0.02g·mL-1H2SO4的混合液(1∶1，V/V)中，调pH值=1,定容至100 mL得备用液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取0.1000 g 硫酸软骨素对照品，定容至100 mL，分别精确量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的硫酸软骨素溶液加入至具塞试管中，在各个试管中分别加入蒸馏水1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 mL。在各个试管中添加提前溶解好的阿利新蓝溶液15 ml，放置15 min后得备用液。

2.3 吸收波长的确定

采用阿利新蓝比色法，以硫酸软骨素为对照品，在300～700nm处进行全波长扫描。

2.4 供试品溶液的制备

精密称取蜘蛛粉1.0000 g,按1∶2加入石油醚和无水乙醇进行脱脂2h，脱脂、抽滤后按一定的料液比加入蒸馏水。然后在40 ℃，pH值=8，胰蛋白酶2000 U的条件下酶解3h，然后在一定的温度和时间下进行超声提取2次，进行抽滤，收集滤液,放至4℃冰箱保存备用。

2.5 标准曲线的制作

精密称取0.1000 g硫酸软骨素对照品，定容至100 mL，分别精确量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的硫酸软骨素溶液加入至具塞试管中，在各个试管中分别加入蒸馏水1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 mL。各个试管中添加提前溶解好的阿利新蓝溶液15 mL，放置15 min。在490 nm波长处测定吸光度。以波长(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。

2.6 单因素实验

2.6.1 料液比对蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在确保提取温度50 ℃、提取时间80 min 不变的情况下，改变料液比，在料液比 1∶20，1∶30,1∶40,1∶50,1∶60 g·mL-1下提取糖胺聚糖，考察料液比对糖胺聚糖提取量的作用。

2.6.2 提取时间对蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在确保液料比 1∶40 g·mL-1，提取温度50 ℃ 不变的情况下，改变提取时间，在提取时间为60、70、80、90、100 min下提取糖胺聚糖，考察提取时间对糖胺聚糖提取量的作用。

2.6.3 提取温度对蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在确保料液比 1∶40 g·mL-1，提取时间80min不变的情况下，改变提取温度，在提取温度为30、40、50、60 ℃ 下提取糖胺聚糖，考察提取温度对糖胺聚糖提取量的作用。

2.7 正交试验设计

在单因素实验的基础上，以料液比(A)，提取时间(B)，提取温度(C)为三个考察因素。优化蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取工艺，采用 L9(34)正交试验，见表1。

表1 正交试验因素

2.8 数据处理

数据采用SPSS19.0进行单因素方差分析，P<0.05为统计学显著差异的标准[20-21]。

3 结果与分析

3.1 硫酸软骨素标准品最大吸收波长

经在可见光下扫描，确定硫酸软骨素最大吸收波长在490 nm处，如图1所示。

图1 硫酸软骨素全波长扫描图

3.2 标准曲线的线性与范围

硫酸软骨素对照品标准曲线方程为：y=1.0137X-0.0004，R2=0.9993,见表2及图2。

表2 硫酸软骨素线性关系实验结果

图2 硫酸软骨素标准曲线

3.3 单因素试验

3.3.1 液料比对蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量随着料液比的增大先增加后降低，在料液比为1∶40 g·mL-1处出现最大值，可能由于料液比过小，则糖胺聚糖溶出量为饱和，不利于糖胺聚糖的充分溶出；而当料液比过高，非糖胺聚糖类物质竞相溶出导致糖胺聚糖溶出量减少[22]。所以确定糖胺聚糖提取的最佳提取料液比为1∶40 g·mL-1。结果见图 3。

图3 料液比对糖胺聚糖提取量的作用

3.3.2 提取时间对蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量随着提取时间增大先增大后逐渐趋于平缓，可能是因为糖胺聚糖浸出量已经达到饱和，不再溶出。从节约能源方面考虑，确定糖胺聚糖提取的最佳提取时间是80 min。结果见图4。

图4 提取时间对糖胺聚糖提取量的作用

3.3.3 提取温度对蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量随着提取温度增大先增加后降低，当温度为50 ℃ 时具有最高点 ，这是因为随温度升高，分子热运动加剧，利于糖胺聚糖破壁溶出，但温度过高，部分蛋白变性失活凝固不利于糖胺聚糖溶出，所以确定糖胺聚糖提取的最佳提取温度为50 ℃。结果见图5。

图5 提取温度对糖胺聚糖提取量的作用

3.4 正交实验

本实验采用的是正交试验法，正交实验结果见表3。

表3 正交实验表结果

表4 方差分析表

注：F0.05(2,2)=19，P<0.05为显著， P<0.01为极显著。

由表4得出：料液比(A)，提取时间(B)，提取温度(C)对蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取均具有明显性的作用。料液比、提取时间、提取温度对糖胺聚糖的提取量作用程度为：料液比(A)>提取时间(B)>提取温度(C)。因此，得到在正交试验范围内的最佳提取条件是A2B3C1，即料液比为1∶40 g·mL-1，提取时间为80 min，提取温度为50 ℃。

3.5 实验验证结果

在正交试验范围内的最佳提取条件A2B3C1下，进行三次实验，进行正交实验验证，实验结果见表5。

表5 实验结果验证

由表5可知，按最佳提取条件：料液比1∶40 mg/mL,提取时间80 min,提取温度50 ℃，从1.0000 g 的蜘蛛粉中提取糖胺聚糖，平均提取量为21.072 mg·g-1，提取量较高且具有重复性，验证了所选提取工艺参数的合理性。

4 讨论

由方差分析得出：料液比对蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用最显著，其中当料液比为1∶40时提取量达到最高。提取时间对蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用的程度比料液比对蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用的程度弱一点，当提取时间为80 min时提取量较高。提取温度对蜘蛛粉糖胺聚糖的提取效果也有较大的作用，但不如料液比及提取时间对蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取的作用强。其中，当提取温度为50 ℃ 时，提取含量最高。本实验采用正交实验法优化蜘蛛粉中糖胺聚糖最佳提取工艺，通过实验结果得出料液比对糖胺聚糖的提取作用最显著，是蜘蛛粉中糖胺聚糖提取的关键因素。通过最佳提取工艺，对蜘蛛粉中糖胺聚糖进行提取，提取量为21.072 mg·g-1，试验方法重复性高，可用于其他药物糖胺聚糖工艺提取。

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