中药石韦中黄酮类化合物的含量及抗氧化活性研究

唐雅楠，曹雪原，邵 尉，高德民

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

《中国药典》(2015版)规定中药石韦(Pyrrosiae folium)的基源植物为水龙骨科石韦属植物：石韦、庐山石韦和有柄石韦，其广布于华中、西北和西南各省区，地上部分可作药用，味苦、甘，性微寒，具有利尿通淋、清肺止血的功效[1]。石韦属药材的主要有效成分包括绿原酸、杧果苷、异杧果苷、槲皮素、异槲皮素、里白烯、β-谷甾醇、蔗糖等多种成分[2]，其中黄酮类成分十分丰富。黄酮类化合物是广泛存在于自然界中，且较早被人类发现的一类天然化合物，常以游离态或与糖结合成苷的形式存在[3]，在生物体内有预防心血管疾病、防癌抗癌、调节免疫、抗衰老、抗菌抗病毒、抗炎抗过敏、止血阵痛等诸多功效[4]。天然黄酮类化合物的作用及价值已受到了普遍的关注[5]，目前已在众多中草药中提取出了黄酮类化合物，如肉桂[6]、沉香叶、金莲花[7等，而有关石韦黄酮类化合物的研究报道较少，因此，本研究通过对中药石韦中黄酮类化合物的分离纯化及抗氧化活性研究，有助于为进一步开发中药石韦提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

紫外-可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；RE52AA 旋转蒸发器(菏泽鑫源仪器仪表有限公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-S水浴锅(济南启科仪器有限公司)。

1.2 试剂

聚酰胺(60 ～ 100目)；石油醚；乙酸乙酯；正丁醇；无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；双氧水(山东利尔康医疗科技股份有限公司)、FeSO4、水杨酸、抗坏血酸、邻苯三酚、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)等均购自科密欧。

1.3 材料

实验所用药材均购自漱玉平民大药房，经山东中医药大学高德民副教授鉴定为中药石韦。

2 方法

2.1 黄酮类化合物的提取

中药石韦粉碎，过2号筛，石油醚充分搅拌后浸泡过夜(料液比1∶20)[8]。抽滤，晾干后粉末加70%乙醇(料液比1∶20)，60℃下超声提取40 min[9]，抽滤得到提取液，提取液减压浓缩，备用。

2.2 黄酮类化合物的分离

将上述提取液，加入适量乙酸乙酯反复多次萃取，待乙酸乙酯层无色后，合并乙酸乙酯萃取液。用水饱和正丁醇溶液继续萃取，待正丁醇层无色后停止，合并正丁醇萃取液。将乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别减压浓缩，干燥后，乙酸乙酯萃取物记为S1，并进行聚酰胺分离，正丁醇萃取物记为S5。

2.3 聚酰胺柱色谱纯化

方法参考赵春艳[10]对沙葱中黄酮类化合物分离纯化的研究，分别用30%、50%、75%乙醇对乙酸乙酯萃取物(S1)洗脱，洗脱液经减压浓缩并蒸干后得到3个样品，分别记为S2、S3、S4，然后进一步干燥成粉末，备用。

2.4 样品黄酮类化合物含量的测定

2.4.1 标准曲线的制定

芦丁标准液曲线的制作参考王瑞兰等[11]人对庐山石韦中黄酮提取工艺的研究，得标准曲线回归方程Y=13.038X-0.0131，R2=0.9987。

2.4.2 样品中黄酮类化合物含量的测定

取适量S1、S2、S3、S4和S5溶于少量乙醇，经适当稀释后，按照上述方法测定待测液中黄酮含量。按照回归方程计算样品中黄酮类化合物含量，平行试验3次。

2.5 样品抗氧化活性的测定

2.5.1 DPPH自由基清除能力测定

分别移取2 mL不同浓度的样品醇溶液于试管中，各加入2 mL 0.08 mmol/L 的DPPH溶液，避光反应30 min 后，在517 nm 处测得吸光度Ai。用抗坏血酸作阳性对照。清除率计算公式如下：

清除率%= [1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0为蒸馏水代替样品时的吸光度，Aj为无水乙醇代替DPPH时的吸光度。

2.5.2 羟基自由基清除能力测定

分别移取2 mL 不同浓度的样品醇溶液于试管中，加入2.5 mmol/L 的FeSO4溶液、2.5 mmol/L 的水杨酸溶液各1 mL，最后加入1 mL 2.5 mmol/L 的H2O2溶液，静置30 min，在510 nm 处测得吸光度Ai。用抗坏血酸作阳性对照。清除率计算公式如下：

清除率%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0为蒸馏水代替样品时的吸光度，Aj为蒸馏水代替H2O2溶液时的吸光度。

3 结果

3.1 样品中黄酮类化合物的含量

表1 黄酮类化合物的含量(n=3)Table 1 The content of flavonoids(n=3)

用硝酸铝比色法测定各样品中黄酮类化合物含量，结果表明：S1中黄酮类化合物的含量大于S5中黄酮类化合物的含量；S4中黄酮类化合物的含量最高，为0.5834 mg/mL；S1其次，黄酮类化合物的含量为0.5165 mg/mL；S5再次，黄酮类化合物的含量为0.4622 mg/mL；S2最少，黄酮类化合物的含量为0.2509 mg/mL。

3.2 样品的抗氧化活性

3.2.1 样品对DPPH自由基的清除能力

图1 样品对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH radical by samples

通过DPPH法测得各样品抗氧化活性，结果表明：在0～200μg/mL 范围内，样品的抗氧化活性随黄酮类化合物浓度的增高而增高，当浓度为200μg/mL 时，Vc的清除率为96.46%，S4的清除率为78.20%，S5清除率为63.8%，S3清除率为61.05%，S2清除率为48.84%，其清除率从大到小的顺序为：Vc>S4>S5>S3>S2。通过计算IC50得：Vc的IC50值为16.7963μg/mL，S4的IC50值为55.6263μg/mL，S5的IC50值为76.5435μg/mL，S3的IC50值为101.5624μg/mL，S2的IC50值为212.4524μg/mL，进一步说明S4的清除率最大，S5的清除率次之，S2的清除率最小，但均不如Vc。

3.2.2 样品对羟基自由基的清除能力

图2 样品对羟基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of hydroxyl radical by samples

通过羟基自由基法测得各样品抗氧化活性，结果表明：在0～200μg/mL 范围内，样品的抗氧化活性随黄酮类化合物浓度的增高而增高，当浓度为200μg/mL 时，Vc的清除率为97.68%，S4的清除率为75.72%，S5清除率为65.40%，S3清除率为59.78%，S2清除率为51.32%，其清除率从大到小的顺序为：Vc>S4>S5>S3>S2。通过计算IC50得：Vc的IC50值为18.3324μg/mL，S4的IC50值为45.0582μg/mL，S5的IC50值为76.2069μg/mL，S3的IC50值为110.1429μg/mL，S2的IC50值为245.5703μg/mL，进一步说明S4的清除率最大，S5的清除率次之，S2的清除率最小，但均不如Vc。

4 讨论

中药石韦作为一种常用中药材，近年来被广泛用于各种复方制剂中[12，黄酮类化合物作为中药石韦中一类含量丰富的有效成分，本实验通过超声提取法对中药石韦中黄酮类化合物进行提取；用硝酸铝比色法测定各样品中黄酮类化合物含量；通过聚酰胺柱色谱对乙酸乙酯萃取物(S1)进行分离纯化。结果表明黄酮类化合物含量从大到小依次为：S4>S1>S5>S3>S2。通过DPPH法和羟基自由基法测得各样品抗氧化活性，结果表明其对DPPH自由基的清除率和对羟基自由基的清除率从大到小都为：S4>S5>S3>S2。其中75%乙醇洗脱获得的样品(S4)中的黄酮类化合物含量最高，其抗氧化活性也最强，说明聚酰胺柱对中药石韦中的黄酮类成分具有较好的富集纯化作用；而且，中药石韦中的黄酮类化合物有较好的抗氧化活性。通过对中药石韦中黄酮类化合物含量和抗氧化活性的测定，有助于为进一步开发石韦提供依据。

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