三七基因组SSR位点分析和多态性引物开发

揭应碧 卢迎春 宋婉玲 韦坤华 张广辉 杨生超

摘 要 本研究通过分析三七（Panax notoginseng）基因组中简单重复序列（simple sequence repeats，SSRs）位点信息，对基因组中SSR位点的分布特征进行描述，并开发多态性引物，为评价三七遗传多样性和群体结构提供理论依据。利用MISA软件对重新组装的三七基因组进行SSR位点搜索，primer3设计引物。用随机合成的200对引物，在16个三七单株中进行PCR扩增，来筛选具有多态性的引物。在去除冗余序列后组装得到2.39 Gb大小的三七基因组中总共识别到314 060个SSR位点，SSR分布频率为0.13/kb，其中占主导地位的是二核苷酸重复基序，占所有重复基序类型的68.55%，其次是三核苷酸56 250（17.91%）和单核苷酸22 475（7.16%）。在二核苷酸为主的重复类型中，出现频率最高的是AT/AT重复基序占所有二核苷酸重复的63.66%，最低的是CG/CG重复基序占0.15%。同时，在单核苷酸重复中出现频率最高的也是A/T重复类型（79.01%）。经过多态性筛选最终得到41对多态性较好的引物，PIC值范围为0.11～0.78，平均值为0.46。本研究获得的大量SSR位点信息为三七全基因组SSR标记的开发，三七分子标记辅助育种以及遗传多样性分析提供方便。

关键词 三七；基因组；SSR；多态性

中图分类号 S31 文献标识码 A

Abstract The analysis of simple sequence repeat （simple sequence repeats； SSRs） site information in the genome of P. notoginseng was used to describe the distribution characteristics of genome SSR loci， and to develop polymorphic primers to evaluate the genetic diversity and population structure of P notoginseng. MISA software was used to search for the SSR loci of the assembled genome of P. notoginseng. Primers were designed by Primer3， and 200 pairs of primers randomly synthesized were used to amplify PCR in 16 P. notoginseng plants to screen primers with polymorphism. Totally， 314， 060 SSR loci were identified， with an average distance of 0.13 kb between each loci. A large proportion of the SSRs included di-， tri-and mono- repeat motifs， which accounted for 68.55%， 17.91% and 7.16% of all repeats， respectively. Dinucleotide is the main type of repeated categories， the highest frequency of occurrence was AT/AT which accounted for 63.66% in total di- repeats， whereas the lowest frequency of occurrence was CG/CG （0.15%）. A/T was the most common in mononucleotide repeat （79.01%）. After polymorphic screening， we obtained 41 primers with preferable polymorphic primers. The PIC value was 0.11～0.78， with an average of 0.46. Plenty of the SSR locus information and SSR markers were provided in this research， not only provide valuable resources for the development of SSR markers in P. notoginseng， but also provide convenience for P. notoginseng marker-assisted breeding and genetic diversity analysis.

Keywords Panax notoginseng； genome； SSR； polymorphism

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.014

简单重复序列（simple sequence repeats，SSRs）或微卫星标记，是由1～6个核苷酸多次串联重复的DNA序列，是基因组中丰富存在的、均勻分布的共显性和多等位基因的分子标记，而且容易被检测[1～4]。这些特性使得SSR标记成为植物分子标记辅助育种、遗传资源DNA指纹图谱分析、图位克隆基因等研究的重要工具之一。最初，大多数植物的SSR标记主要来自表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）和细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）序列。近年来，随着越来越多的植物基因组测序的完成，也从基因组中鉴定了大量SSRs标记[5～8]。但是，多集中于模式植物和主要的农作物等，其他植物由于缺乏基因组序列，基于基因组的SSR标记开发也鲜有报道。

三七（Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen）为五加科人参属多年生草本植物，以根及根茎入药，具有散瘀止血、消肿定痛、防止脑缺血、止血、降脂和保护肝脏等功效[9-10]。据考证，三七至少已有400年以上的栽培历史[11]。但是，几百年来，一直没有选育出用于推广种植的品种，生产上长期使用混杂的种质，导致三七遗传多样性逐渐丧失[12]，直接影响三七药材的产量和品质，表现为三七植株个体间表型差异巨大[13]，主要皂苷组分含量也相差3.6～10.2倍[14]。同时，居群内遗传多样性丰富，而居群间遗传分化水平低，遗传差异主要存在于居群内[15-16]。因此，三七新品种选育是生产上亟待解决的关键科学问题之一。

开发有效的分子标记是植物育种的重要手段之一。前人曾利用fAFLP（fluorescent amplified fragment length polymorphism）和EST-SSR等对三七群体的遗传多样性进行分析[15-16]。杨云[17]利用ISSR（inter-simple sequence repeat）和SRAP（sequence-related amplified polymorphism）对三七集团选择后代群体进行了遗传一致性分析，并选育了2个新品种“滇七1号”和“苗乡三七1号”，其中“滇七1号”的主要特征为茎翠绿色、存苗率高；“苗乡三七1号”茎则为紫色，抗性强，皂苷含量高。近年来，利用转录组测序开发了人参属植物大量EST-SSR标记[18-20]，但EST-SSR的覆盖度低、不包含非基因非编码区，从而限制了其应用。

2017年，中药材课题组率先发布了三七基因组（包括转录本），组装的三七基因组草图大小为2.39 Gb，contig N50和scaffold N50分别为16 kb和96 kb[21]。基因组测序的完成为三七育种和药效成分生物合成关键酶基因的发现提供了基础。本研究分析比较了三七基因组和转录组的SSR位点信息差异，利用三七基因组SSR位点开发了大量引物，并随机选择了200对引物进行了多态性验证，从中筛选出了41对多态性引物。本研究为三七SSR标记开发提供坚实基础，也为三七种源遗传多样性鉴定等提供了有效的工具。

1 材料与方法

1.1 三七基因组中SSR位点信息的搜索

利用软件MISA（microsatellite identification tool， http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）搜索三七基因组中的SSR位点。搜索标准选择重复单元为1、2、3、4、5、6个碱基的基序，最小重复数分别为12、6、5、5、4、4。2个相邻SSR之间的碱基数≤100，则被定义为复合型SSR。为比较转录组中SSR位点和基因组SSR位点差异，本研究下载了三七不同部位转录组原始测序reads[19]（NCBI Sequence Read Archive登录号为PRJNA228978），混合组装，并分析其SSR位点（不包含单核苷酸重复）。

1.2 三七SSR引物设计与合成

根据SSR位点两端的保守序列，利用primer3（http：//primer3.sourceforge.net/）设计引物，引物长度20～23 bp，退火温度60 °C左右；引物中碱基重复数小于等于4，引物两端不能有2个连续的A/T碱基；PCR产物大小在150～300 bp。随机选择200对引物，由昆明硕阳科技有限公司合成，以筛选多态性引物。

1.3 引物多态性验证

在云南文山市苗乡三七科技园（文山市砚山县），随机采集16个单株的新鲜叶片用于多态性引物筛选，其中自然群体6个单株、苗乡三七1号6个单株和滇七1号4个单株。EasyPure Plant Genomic DNA Kit（北京全式金生物技术有限公司）提取基因组DNA。引物合成时在正向引物5′端加M13F通用引物序列（5′-TGTAAAACGA?CGG?CCAGT-3′），第一次PCR扩增后产物带上M13F序列。选择第一次PCR中条带理想的产物进行二次扩增，用带有不同颜色且序列和M13F一致的荧光引物（A603012557Hex和A6030125?56?Fam）替換原来的M13F序列，目的是使得二次扩增产物带有荧光便于检测。

第一轮PCR扩增的反应体系为15 ?L，包含7.5 μL mix，正向和反向引物各1.0 μL，基因组DNA 1.0 μL和4.5 μL ddH2O；扩增程序94 ℃预变性5 min，然后进行30个循环，每个循环包含94 ℃变性30 s，最佳退火温度退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。以第一轮PCR的产物为模板进行第二轮PCR扩增，15 μL PCR反应体系包含7.5 μL mix，1 μL反向引物、一次扩增产物1.0 μL、荧光引物1.0 μL和4.5 μL ddH2O。扩增程序和一次扩增相同，将二次扩增的产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物进行相应的稀释定量，将稀释后的两种不同的荧光引物混合加入一个孔内，体积各为0.5 μL，加入10 μL的GS500LIZ组成11 μL反应体系，离心，95 ℃变性5 min，–20 ℃冰箱保存。

1.4 数据分析

用软件GeneMapper v4.1对测序结果分析位点多态性，根据产生的峰图确定核心位点片段大小，选择特异性高、多态性好的位点峰图产生的Excel数据，POPGENE32计算每个标记的等位基因数、Shannon指数，软件PIC CALC计算每个标记的多态性信息含量，统计分析时将SSR视为共显性标记。

2 结果与分析

2.1 三七基因组中SSR信息位点的分布特征

三七基因组122 131条scaffold中共包含314 060个SSR位点，分布于36 763条scaffold上，其中26 500条scaffold含有一个以上SSR位点，复合型SSR有46 463个（表1）。相反，在三七转录组的45 678条unigenes中，识别到了4 756个SSR位点，同样地，在454测序的三七根部转录组的2 361条特异序列中识别到2 772个SSR基序。在三七转录组中每Mb有134.73个SSR，位點发生频率为7.43 kb/SSR。三七基因组每Mb有131.00个SSR，SSR位点的发生频率为7.62 kb/SSR。

三七基因组中，二核苷酸重复单元占有绝对优势，占总数的68.55%；其次是三核苷酸重复，占总数的17.91%；同样，在三七转录组中，二核甘酸重复也最多（40.81%），三核苷酸重复所占比例也很高（36.67%）。在三七根部转录组中二核苷酸重复（67.53%）也是最多的，几乎是三核苷酸重复（25%）的3倍（表2）。和许多植物基因组相似，三七基因组中较短重复基序（mono-、di-、tri-）所占比例明显高于较长重复基序（tetra-、penta-、hexa-）所占比例，这一结果表明在大多数植物中基序长度的分布基本一致。从SSR重复次数来看，基因组和转录组中的SSR位点都是6次重复最多，分别是11.64%和27.12%；5次重复和7次重复的比例也很高。特别地，转录组中4次重复的SSR的比例也很高，达到16.97%（表2），但是不论在基因组还是转录组中SSR频率的整体变化规律是随着基序长度的增加而减少。

在单核苷酸重复中和C/G相比出现数目最多的是A/T重复单元，占所有单核苷酸重复的79.01%。在二核苷酸重复中出现数目最多的是AT/AT重复基序，占所有二核苷酸重复基序的63.66%；在三七转录组中除了AT/AT还有AG/CT。三七基因组中二核苷酸重复类型中数目最少的是CG/CG，只有330个，占0.15%。在三七基因组三核苷酸重复序列中，出现最普遍的重复类型是AAT/ATT（53.33%）和AAG/CTT（21.91%），出现数目最少的是ACG/CGT和CCG/CGG，分别只有145和319个，占所有三核苷酸重复基序的0.82%（图1）。然而在三七转录组的三核苷酸重复中，AAG/CTT所占比例最高，CCG/CGG和AAC/GTT最少。

2.2 SSR多态性引物的筛选和验证

本研究随机选择并合成200对三七引物对样本位点进行多态性检测，将所有PCR扩增产物进行毛细管电泳之后用Genemapper v4.1产生的峰图检测样品位点信息，SSR重复基序的重复数目差异以及短的插入缺失事件形成SSR多态性，峰图所显示的信息是带有荧光引物的PCR产物在经过毛细管电泳之后所反馈的产物片段信息。通过分析每一对引物在各个样品中产生的峰图显示的各自特定位点片段大小信息之后，其中有27对引物的峰图大小相同不存在差异，有132对引物没有扩增出片段，最终得到的有41对引物的产物符合预期大小，将这41对引物峰图生成Excel数据表格，用于计算引物多态性信息含量（图2）。

通过软件POPGENE32计算41对引物的等位基因观察值、预期等位基因数、Shannon指数和多态性信息含量，各个位点等位基因数目范围为2～10，平均数目为3.9。计算了41对引物的PIC值，结果见表3，结果发现16对引物具有高度多态性（PIC>0.50），23对引物具有中度多态性（0.25

3 讨论

SSR具有共显性、丰富性和高多态性的特点，并且普遍存在于植物生物基因组中。基于不同植物基因组的调查发现，在拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）中平均1.14 kb发现一个SSR[22]，在水稻（Oryza sativa L.）中平均3.6 kb出现一个SSR[23]，在甘蓝（Brassica oleracea L.）中平均4 kb出现一个SSR[24]，在大豆（Glycine max （Linn.） Merr.）中平均4.5 kb出现一个SSR[25]，在高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）中平均220 kb出现一个SSR[26]，在小麦（Triticum aestivum L.）中平均578 kb出现一个SSR[27]。本研究从三七基因组的122 131条序列、总长度为239 483 436 bp中识别到314 060个SSR信息位点，分布在36 763条序列中，SSR的平均密度为每0.13 kb出现一个SSR。这些结果可能反映出了存在于植物基因组间的DNA水平的真实遗传差异，或者各项研究使用了不同的测序方法和测序程序。

三七的基因组中识别到的SSR基序以二核苷酸为主，占所有识别到的SSR基序的68.55%，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸所占比例的总和为6.39%。这一结果和许多植物中二核苷酸重复基序在植物基因组中所占比例较高是一致的[28-31]。和许多植物中单核苷酸重复占主导位置的结果不同[32]，这一结果表明SSR在不同物种以及相同物种的不同重复类型之间是存在差异的。从另一方面讲，拥有大量短重复类型的SSR位点的物种通常表现出较高的基因组突变率[33-35]。

在单核苷酸重复中A/T基序明显高于C/G重复，同时本研究发现AT/AT重复基序是二核苷酸重复类型中出现频率最高的，然而CG/GC重复基序是出现频率最低的，这一结果和毛果杨（Populus trichocarpa Torr. & Gray）和落花生（Arachis hypogaea Linn.）中AT/AT重复基序在二核苷酸中出现频率最高是一致的[36-37]。许多研究表明，在植物基因组中二核苷酸基序中，（AT）n是最普遍的[37-38]。这一结果和许多植物基因组中富含AT碱基的重复类型所占比例高于富含CG的重复类型是一致的[39-43]。

综上所述，本研究从三七的基因组中分析得到了丰富的SSR位点信息。对200对引物进行多态性筛选后，计算PIC值范围是0.06～0.78，平均值为0.46，最终获得41对特异性高、多态性好的引物，多态性位点获得率为20.5%。同时用3种不同居群的三七材料对筛选的41对引物进行多态性验证，最终将材料大致分为3类：紫茎、绿茎和对照。其中部分对照分别和绿茎、紫茎聚在一起，这可能跟紫茎和绿茎三七是由对照三七经过长期栽培选育所得有关。因此本研究获得的引物具有较高的多态性潜能，可以用于区分不同居群性状差异的三七，同时这些丰富的SSR位点将从基因层面揭示三七相关性状的本质，对进一步研究三七的遗传多样性、加速三七功能基因资源的开发利用、丰富其分子标记类型、遗传资源评价、绘制遗传图谱、实现特定性状的辅助选择和进行比较基因组学研究都具有重要的意义。

致谢 感谢提供实验材料的云南文山苗乡三七科技园，特此谢意！

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