邻苯二甲酸二甲酯（DMP）对黑腹果蝇生长发育及繁殖的影响

李 洁，王建福，马玲玲，邱国斌，刘 珽

（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070）

邻苯二甲酸二甲酯（DMP）等邻苯二甲酸酯类（PAEs）是塑料工业使用最广泛、品类最多、产量最大的增塑剂，在塑料、建筑材料、服装、化妆品、医药品、食品包装材料乃至儿童玩具中均有使用［1］。DMP与多种树脂都有很强的溶解力，可与多种纤维素树脂、橡胶、乙烯基树脂相溶，有良好的成膜性、粘着性和防水性［2］。同时，DMP还可用作驱蚊油（原油）、聚氟乙烯涂料、过氧化甲乙酮等的溶剂。伴随塑料制品的生产、使用和废弃，DMP可不断地释放出来，进入环境和生物体，造成潜在的危害。美国国家环境保护局列出6种PAEs类化合物作为重点污染物，DMP位列之首，DMP等邻苯二甲酸酯类也被列为中国环境水中优先控制污染物黑名单［3］。刘慧杰等［4］、胡晓宇等［5］研究表明，PAEs具有内分泌干扰效应，对生物生长发育具有一定毒性。周科等［6］研究发现，DMP对鲤鱼肝细胞造成了一定的损伤，肝脏合成酶也随之受到影响。但DMP对果蝇生殖功能和遗传突变的报道较少。果蝇是真核多细胞生物，也是一种经典模式生物，作为试验动物，具有饲养容易、生存周期短、繁殖能力强和反应灵敏等特点，其代谢系统、生理功能和生长发育同哺乳动物有许多相似之处。在25℃左右10 d即可繁殖1代，1只雌性果蝇1次能繁殖近百只，可在较短时间得出结论。我们从果蝇蛹化率、羽化率、产卵时间、蛹化时间、羽化时间和果蝇繁殖数量6个方面探讨了DMP对果蝇生长发育和繁殖的影响，以期对评估塑料污染和含PAEs材料制品对人类健康的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试动物

试验指示动物为甘肃农业大学动物科学技术学院遗传实验室提供的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。

1.2 试验材料及设备

1.2.1 材料 玉米粉、白砂糖、琼脂（天津市致远化学试剂有限公司）、酵母浸粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）、丙酸（天津市凯信化工业有限公司）、邻苯二甲酸二甲酯（分析纯，天津市光复精细化工研究所）、蔗糖脂肪酸酯（乳化剂，食品级，柳州爱格富食品科技股份有限公司）、乙醚。

1.2.2 设备 RXZ型智能人工气候箱（宁波市仪器厂制造）、XH-B型漩涡混匀器（姜堰市康健医疗器具有限公司）、YXQ-LS-SH全自动立式电热压力蒸汽灭菌器（上海博讯试业有限公司医疗设备厂）、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、移液器（TopPette）、万用电炉（北京永兴仪器有限公司）、体视显微镜（Motic，厦门麦克奥迪实业集团有限公司）、培养瓶（30mL）、烧杯（50、100、1 000 mL）、麻醉瓶、拨针、玻璃棒、记号笔。

1.3 实验方法

试验于2016年6—12月在甘肃农业大学动物科学技术学院动物遗传育种与繁殖实验室完成。

基本培养基配制：将玉米粉56 g、白砂糖44 g、琼脂粉5 g溶解于150 mL蒸馏水并搅拌均匀，然后用电炉边加热边搅拌至煮沸呈粘稠状，冷却5 min后加入酵母粉5 g、丙酸3 mL，边搅拌边装瓶，每瓶培养基厚度为0.5～1.0 cm。1份基本培养基分装12～15瓶。

染毒培养基配制：用移液器量取0、0.1、0.5、2.5、7.5 mL DMP标准液，分别添加到100 mL乳化剂（含2%蔗糖脂肪酸酯）中稀释，并用漩涡混匀器充分混匀，配成质量分数为0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的DMP应用液。将不同质量分数的DMP应用液加入基本培养基并搅拌均匀，装入培养瓶中，每瓶培养基厚度为0.5～1.0 cm，制成DMP质量分数分别为0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的染毒培养基。以基本培养基作为对照组，每组均设5个重复。

1.4 测定方法

1.4.1 蛹化和羽化测定 将未交配的雌雄黑腹果蝇放入基本培养基中使其交配产卵12 h，然后将成虫倒出。把含有卵的培养基放入智能人工气候箱中培养，培养温度为25℃，在12 h内收集一龄幼虫并放到含有不同浓度组的DMP染毒培养基中饲喂，每个培养瓶中放一龄幼虫20只。从放入一龄幼虫到培养基中出现蛹化时计时，每2 h观察记录蛹化时间及蛹化数。蛹化全部完成后每2 h观察并记录羽化时间，记录新产生的羽化数，直至成蝇不再出现。

1.4.2 产卵时间测定 取未交配的黑腹果蝇50只，雌雄各半。用乙醚浅度麻醉后随机配对25组，分别放入DMP质量分数分别为0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的培养基中饲喂，每个质量分数梯度设置5组平行培养基，每瓶有1雌1雄共2只果蝇，观察其生长情况。从放入未交配的果蝇开始计时，每2 h观察记录1次，瓶壁上出现约0.5 mm的椭圆形白色小点则表明开始产卵，从计时到开始产卵的时间段为产卵时间。每对果蝇培养7 d后，转移至含相同培养基的果蝇瓶（新瓶）中培养，依照以上步骤培养3次。

1.4.3 繁殖量测定 随机挑选饲喂基本培养基上的未交配果蝇，雌雄各半，放到不同质量分数的DMP染毒培养基上饲喂，每1质量分数梯度设置5瓶重复，每瓶有1雌1雄共2只作为亲本。每对亲本果蝇培养7 d后，转移至含相同质量分数培养基的培养瓶（新瓶）中培养，移除亲本后的培养瓶（原瓶）继续培养。7 d后移除亲本的培养瓶（原瓶）中出现的F1代果蝇，连续7 d统计羽化数量，计为其1期繁殖数量。转移至新培养瓶（新瓶）继续培养亲本，在新瓶中培养7 d后做同上处理，计为第2期繁殖数量。重复以上步骤，统计第3期繁殖数量（以7 d记录为1个周期，共研究3个周期即 21 d）。

2 结果与分析

2.1 DMP对黑腹果蝇生长发育的影响

从表1可以看出，随着DMP质量分数的增加，黑腹果蝇的蛹化数呈先增加后降低的趋势，但2.5%以下的DMP质量分数组差异并不显著（P＞0.05），DMP质量分数为7.5%组的蛹化数显著低于0.1%质量分数组（P＜0.05）。随着DMP质量分数的增加，黑腹果蝇的羽化数有逐渐下降的趋势，但2.5%以下的DMP质量分数组差异并不显著（P＞0.05），7.5%组的羽化数显著低于对照组和0.1%组（P＜0.05）。

表1 不同质量分数DMP对黑腹果蝇一龄幼虫蛹化和羽化的影响①

2.2 DMP对黑腹果蝇繁殖的影响

2.2.1 DMP对黑腹果蝇产卵时间的影响 由表2可以看出，3期黑腹果蝇的平均产卵时间均在DMP质量分数为7.5%时最迟。第1期平均产卵时间在0.1%时最早，与除2.5%组以外的其他各组差异显著（P＜0.05），对照组与0.5%、2.5%、7.5%组的产卵时间无显著差异（P＞0.05）；第2期平均产卵时间在DMP质量分数0.1%时最早，与除对照组以外的其他各组差异显著（P＜0.05），0.5%组的产卵时间显著迟于0.1%组和对照组（P＜0.05），同时也显著早于7.5%组（P＜0.05），但与2.5%组差异不显著（P＞0.05）；第3期平均产卵时间在DMP质量分数为2.5%时最早，但其与除7.5%组之外的其他各组差异均不显著（P＞0.05）。

表2 不同质量分数DMP处理黑腹果蝇的平均产卵时间 d

2.2.2 DMP对黑腹果蝇繁殖数的影响 从表3可以看出，3期黑腹果蝇的平均繁殖数均表现出随着DMP质量分数的增加而先增加后降低的趋势。第1期平均繁殖数在DMP质量分数为0.5%时最高，显著高于除0.1%组以外的其他各组（P＜0.05）；7.5%组的平均繁殖数最低，显著低于其他各组（P＜0.05）。第2期平均繁殖数在DMP质量分数为0.5%时最高，显著高于除0.1%组以外的其他各组（P＜0.05）；7.5%组的平均繁殖数最低，显著低于其他各组（P＜0.05）。第3期平均繁殖数在DMP质量分数为0.5%时最高，显著高于其他各组（P＜0.05）。从图1可以看出，第2期繁殖的个体与正常果蝇对比形态发生了变化，有白体、残翅和瘦小等症状（b、c左为正常），部分伴有畸形，如腹部弯曲、细尖，背部肿胀突起。据此推测DMP可能对果蝇的生长发育有致畸性的影响。

表3 不同质量分数DMP处理的黑腹果蝇繁殖数 只

3 结论与讨论

邻苯二甲酸二甲酯（DMP）对黑腹果蝇的生长发育具有一定的抑制作用，高质量分数的抑制作用更为明显。随着邻苯二甲酸二甲酯（DMP）质量分数的增加，黑腹果蝇的繁殖性能表现出先升高后降低的趋势。高质量分数的DMP可能对黑腹果蝇具有一定的致畸作用，但仍需进一步证实。

刘慧杰等［4］、胡晓宇等［5］的研究表明，邻苯二甲酸酯类（PAEs）具有内分泌干扰效应，对生物的生长发育具有一定的毒性。另外，有研究表明，邻苯二甲酸二甲酯（DMP）对细菌、藻类和马铃薯的生长均有明显的抑制作用，随着质量分数的升高其抑制作用随之增强［7-10］。随着DMP质量分数的升高，马铃薯可溶性蛋白含量呈下降趋势，使马铃薯的生长受阻。邻苯二甲酸二甲酯（DMP）也可使细菌的形态发生变化，对菌体变长的影响与本文对果蝇形态的研究结论相似。

图1 第2期黑腹果蝇繁殖个体比较

用不同质量分数邻苯二甲酸二甲酯（DMP）处理后的培养基饲喂的黑腹果蝇，其蛹化数和羽化数表现出降低的趋势，尤其在7.5%的高质量分数组下降明显，可见邻苯二甲酸二甲酯（DMP）对黑腹果蝇的生长发育具有抑制效应，且高质量分数组的抑制效应更明显。高质量分数的邻苯二甲酸二甲酯（DMP）对黑腹果蝇产卵时间有明显的延迟作用，而低质量分数组则影响较小。随着邻苯二甲酸二甲酯（DMP）质量分数的升高，本试验中黑腹果蝇繁殖数量先升高后降低，这与蔺琰东等［10］马铃薯组培苗SOD活性呈升后降的变化趋势的结论一致。随着饲喂培养基邻苯二甲酸二甲酯（DMP）质量分数的升高，0.1%组和0.5%组与对照组相比，黑腹果蝇的繁殖数量逐渐增多；2.5%组和7.5%组与对照组相比黑腹果蝇的繁殖数逐渐减少，此结果与徐曼妮等［11］利用邻苯二甲酸二丁酯处理果蝇的结果一致。可能是低质量分数的邻苯二甲酸二甲酯（DMP）有促进黑腹果蝇繁殖的效应，而高质量分数的邻苯二甲酸二甲酯（DMP）又会抑制这种效应，其具体的影响机制还有待进一步从生理生化指标变化以及分子水平上做深入研究。从3期培养黑腹果蝇的繁殖数量上来看，第2期繁殖数量最多，第3期繁殖数量则明显降低，可能与亲本果蝇的老年化有关。在试验观察过程中还发现，第2期和3期培养的黑腹果蝇还出现了白体、残翅和瘦小等异常症状的个体，部分个体还出现了腹部弯曲、细尖，背部肿胀突起等畸形，并且随着DMP质量分数的增加，异常个体和畸形个体出现了增多的趋势，推测高质量分数的邻苯二甲酸二甲酯（DMP）可能对黑腹果蝇有一定的致畸作用，但仍需要做进一步的验证性研究。

参考文献：

［1］吴德生，秦逍云，谭 琴，等.邻苯二甲酸酯类化合物的生殖毒性及其环境内分泌干扰效应［J］.癌变·畸变·突变， 2015， 27（ 4）： 316-318.

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［10］蔺琰东，秦舒浩，王 丽，等.外源邻苯二甲酸二甲酯和苯甲酸对马铃薯组培苗生长的化感效应［J］.广东农业科学， 2011， 38（9）： 17-20.

［11］徐曼妮，张欣文，徐思红.邻苯二甲酸二丁酯对雌性果蝇生育力的影响［J］.同济大学学报（医学版），2008， 29（ 1）： 53-55.