野生猕猴桃SOD及多糖的分离纯化工艺研究

薛刚，王莹，刘凤霞，何际芳，沈大战，卞显玲

（1.南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳473000；2.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳473000）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的金属酶。其广泛存在于生物体内，能清除生物体内的超氧阴离子自由基（O2-·），维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶[1-3]。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂，SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前国内提取SOD的来源主要有动物血液、植物和微生物[4]。SOD的提取方法有超声波破碎浸提法、热变性方法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等方法[5-10]。

本文研究从野生猕猴桃中分离获得高活性的SOD，并获得多糖产品，不仅实现了高附加值产品的纯化，同时也实现了野生猕猴桃资源的综合利用，为企业生产SOD及多糖产品提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

原材料野生猕猴桃采自河南省南阳市西峡县。

3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylicacid，DNS）、三羟甲基氨基甲烷、焦性没食子酸、乙酸铅、亚铁氰化钾（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

FD-1C-80多歧管冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；TGL-16gR高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；752N紫外可见分光光度计：上海精科实业有限公司。

1.2 猕猴桃SOD的分离纯化工艺探究

1.2.1 Tris-HCl缓冲液pH值对酶活性检测结果的影响

使用不同pH值的Tris-HCl缓冲液检测标准酶（酶活为3 000 U/mg和6 000 U/mg），使用相同的方法测定其活力，然后选出最佳pH值的缓冲液。

使用上述购买的酶活为3 000 U/mg和6 000 U/mg的SOD产品，在上述选择的最佳pH值条件下进行检测其活性，进一步对选择的测定条件进行验证。

1.2.2 浸提液对SOD酶活性的影响

在相同的条件下选用氯化钠缓冲液和磷酸缓冲液进行试验，然后测定其活性选出最佳的缓冲液。

1.2.3 有机溶剂体系的选择

1.2.3.1 乙醇-氯仿体系混合比例的选择

在最佳的工艺条件下和加量下用 5 ∶3、5 ∶4、5 ∶5、5∶6（体积比）的不同的乙醇-氯仿体系混合进行试验，测其酶活力，选择出最佳的乙醇-氯仿体系混合比例。

1.2.3.2 乙醇-氯仿体系混合体系的加量选择

在以上最佳的工艺条件下以猕猴桃清液体积的30%、40%、50%添加氯仿-乙醇体系混合液，测其酶活，选择出最佳添加比例。

1.2.4 SOD酶活性的测定

SOD酶活力单位定义：每毫克酶在设定条件下，抑制连苯三酚自氧化速度50%时的量为SOD的一个活力单位。

连苯三酚自氧化速率测定体系见表1。

表1 连苯三酚自氧化速率测定体系Table 1 The assay system for the self-oxidation rate of pyrogallol

在试管中按表1加入各种试剂，于25℃保温20min后加入预热的连苯三酚（对照管用10 mmol/L HCl代替），迅速摇匀倒入1 cm比色杯，在325 nm波长条件下，每隔30 s测定吸光值1次，要求自氧化速率控制在0.07/min。测量酶活性按表2加入。

表2 样品SOD活力测定体系Table 2 The assay system for the activity of SOD sample

本次试验SOD产品的酶活力计算公式如下：

式中：U为单位体积活力，U/mg；ν1为样液速率，min；V1为反应液总体积，mL；V2为酶液总体积，mL；m为样品质量，mg。

1.3 猕猴桃多糖的分离纯化工艺探究

1.3.1 样品中还原糖和总糖的测定

1）样品中还原糖的提取：称取3 g猕猴桃多糖粗品，50 mL的蒸馏水溶解，搅拌，于50℃的恒温水浴锅中保温20min，用蒸馏水洗涤烧杯2次～3次后定容到100 mL，以此作为还原糖待测液。

2）样品中总糖的水解和提取：称取1 g粗品猕猴桃多糖，放于100 mL的小烧杯中，并向其中加入10 mL 6 mol/L HCl和15 mL蒸馏水，然后将其放入在沸水浴中进行保温30min后倒入100 mL容量瓶中进行定容，混匀。然后吸取10 mL已经定容过的水解液，移入到另一个100 mL的容量瓶中，然后用蒸馏水定容，用于作为总糖的待测液。

3）显色和比色：取4支具有25 mL刻度具性试管并分别将其将其以此编号，按表3所示的量向试管中精确的加入待测液和试剂。还原糖和总糖的测定体系见表3。

表3 还原糖和总糖的测定体系Table 3 The measurement system of raw sugar and total sugar

按照上述依次加入试剂后，其余的试验操作均按照与制作葡萄糖标准曲线时的加量完全相同，并依次测定各试管中的溶液的吸光值。

4）葡萄糖标准曲线的制作：取7支试管，并编号，依次精确加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加水补充体积至 2.0 mL 后，均加入3，5－二硝基水杨酸试剂1.5 mL。将各管摇匀后，在沸水浴中加热5min后，取出立即放入盛有冷水的烧杯中并冷却至室温，再用蒸馏水定容至25 mL刻度处，并充分摇匀，测定在540 nm波长下的吸光值。以葡萄糖质量为横坐标，以吸光值为纵坐标，得到葡萄糖含量与吸光值之间的线性关系方程。按照下式2、式3和式4分别计算出样品总糖、还原糖和多糖的含量。

式中：X1为还原糖含量，%；X0为总糖含量，%；X2为多糖含量，%；m0为样品质量，mg；m1为经拟合标准曲线方程计算得到的还原糖质量，mg；V0为提取液总体积，mL；V1为测定时取样体积，mL；n为样品稀释倍数。

1.3.2 几种猕猴桃多糖提取工艺的比较

分别选用乙醇－氯仿混合体系和乙酸铅和亚铁氰化钾混合液除杂提取多糖，其工艺流程图如图1、图2所示。

图1 乙醇-氯仿混合体系除杂提取多糖工艺流程Fig.1 The technological process of polysaccharide extraction by ethanol-chloroform hybrid system

图2 乙酸铅和亚铁氰化钾混合液提取多糖工艺流程Fig.2 The technological process of polysaccharide extraction by lead acetate and potassium ferricyanide mixture

2 结果与分析

2.1 Tris－HCl缓冲液pH值对酶活性检测结果的影响

使用不同pH值的Tris－HCl缓冲液检测标准酶（酶活为3 000 U/mg和6 000 U/mg），检测结果如表4。

表4 不同pH值缓冲液处理所得酶的活性检测结果Table 4 The activity test results of the enzyme with different pH buffer

结果显示出不同pH值的缓冲液，SOD酶活性检测结果是不一样的。资料显示[11]使用连苯三酚法检测SOD酶的活性最佳缓冲液pH值为8.2，而本次试验显示，最佳 pH 值为8.6。

2.2 猕猴桃SOD的分离纯化工艺探究

2.2.1 浸提液对SOD酶活性的选择

此次试验用pH7.8的氯化钠缓冲液和pH7.8的磷酸缓冲液作为对照，来确定出最佳的缓冲液。浸提液对SOD酶活的影响结果见表5。

表5 提取液对SOD酶活性的影响Table 5 The effect of extracting solution on SOD enzyme activity

从表5可以看出，两种不同的缓冲液提取出的SOD酶活性差异不太显著。由于磷酸缓冲液浸提过的猕猴桃液只可作为废水处理，而氯化钠缓冲液浸提过的猕猴桃液通过浓缩后可再次加工做成猕猴桃饮料，因此从经济和节约的角度来看，应选用pH值为7.8的氯化钠缓冲液作为本次试验的浸提液。

2.2.2 有机溶剂体系的选择

2.2.2.1 乙醇-氯仿体系混合比例的选择

乙醇-氯仿按照 5∶3、5∶4、5∶5、5∶6体积比例混合，以猕猴桃清液体积的30%添加。乙醇-氯仿对SOD酶活性的影响如表6。

表6 不同比例的乙醇-氯仿混合体系对SOD酶活性的影响Table 6 The influence of different proportion of ethanolchloroform mixed system on SOD enzyme activity

从表6可以看出，当氯仿-乙醇体积比例为5∶3时SOD的酶活最高，所以试验过程中选取5∶3的比例进行蛋白除杂。

2.2.2.2 乙醇-氯仿体系加量的选择

氯仿-乙醇按照3∶5体积比混合，以猕猴桃清液体积的30%、40%、50%添加。乙醇-氯仿的量对SOD酶活性的影响结果如表7。

表7 氯仿-乙醇混合体系对SOD酶活性的影响Table 7 The effect of chloroform-ethanol mixed system on SOD enzyme activity

从表7以可以看出，不同量的氯仿-乙醇对产品活性影响相差很大。当氯仿-乙醇的加入量为30%的时候产品的活性最高，因为氯仿和乙醇结合，不仅可以萃取出溶液中的杂蛋白达到除杂效果，而且可以提取出更高活性的SOD，所以试验过程中应该选择氯仿-乙醇的加入量为清液的30%。

2.2.3 一次丙酮处理与二次丙酮处理的对比试验

经过多次试验证明，在第一次0.6倍的丙酮沉淀出少量的产品和杂蛋白，其中仍含有大量的SOD，经过第二次处理，再次加入1.2倍的丙酮沉淀出的产品，其酶活性大大增加，并且提高了产品质量。从野生猕猴桃中提取的SOD一次处理和二次处理酶活性如表8。

表8 一次处理和二次处理的酶活性Table 8 The enzyme activity of one and two Acetone treatment

由表8得出，一次处理和二次处理之间存在明显的差异，且二次处理结果明显优于一次处理，可以从粗酶中精制出酶活性更高的SOD。

综上，最终确定野生猕猴桃SOD的提取工艺流程如图3所示。

图3 野生猕猴桃SOD提取工艺流程Fig.3 The extraction process flow chart of wild kiwifruit SOD

2.3 猕猴桃多糖的分离纯化工艺探究

用DNS法测定多糖分别测定总糖和还原糖的吸光值，得到葡萄糖含量与吸光值之间的线性关系方程为y=3.45x-0.01，R2=0.998。根据公式计算出样品中多糖的含量，其计算结果见表9。

表9 多糖含量测定结果Table 9 Determination of polysaccharide content

由上述试验结果可以看出，除杂后的多糖含量明显增加，氯仿-乙醇=3∶5（体积比）的混合体系除杂后，多糖的含量增加2.8倍，用乙酸铅和亚铁氰化钾的混合溶液除杂后多糖含量增加3.2倍。由此可见除杂能够明显提高多糖的含量。

3 结论

本次试验得出的最佳工艺为：选择氯化钠缓冲溶液为本次试验的浸提液，最佳的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.6，氯仿-乙醇按照3∶5体积比例混合时其酶活最高，而其加量选为猕猴桃清液体积的30%，经过丙酮除杂后明显可以进一步提高SOD的活力，最终可得提取得到纯化的SOD的酶活力为1 500 U/mg。多糖的最佳工艺为：最佳的除杂剂为乙酸铅和亚铁氰化钾的混合溶液，最终测得的多糖的含量为13.35%。

[1]黎瑞珍,杨庆建,陈贻锐.超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定及其应用研究[J].琼州大学学报,2004,11(5):34-36

[2]李扬,丁喜顺,魏建民,等.沙棘超氧化物歧化酶(SOD)的提取与化学修饰[J].内蒙古农业大学学报(自然科学版),2002,23(3):22-24

[3]陈鸿鹏,谭晓风.超氧化物歧化酶(SOD)研究综述[J].经济林研究,2007,25(1):59-65

[4]章慧慧,励建荣.超氧化物歧化酶的研究和应用现状[J].农产品加工(学刊),2007(8):28-31

[5]单云岗,陈锡林,傅跃青.野生猕猴桃多糖提取工艺研究[J].浙江中医杂志,2015,50(2):146-147

[6]刘海英.响应曲面试验优化猕猴桃中SOD的提取工艺[J].食品研究与开发,2016,37(23):120-124

[7]李珺,马力通,高书良.番茄中超氧化物歧化酶提取工艺的优化[J].安徽农业科学,2012,40(7):3997-3998

[8]王海灵.玉米超氧化物歧化酶(SOD)提取及纯化技术的研究[D].吉林:吉林农业大学,2007

[9]魏瑞锋,魏桃英.猕猴桃中SOD提取工艺研究[J].安徽农业科学,2013,41(32):12716-12717,12757

[10]林庆斌,廖升荣,熊亚红,等.超氧化物歧化酶(SOD)的研究和应用进展[J].化学世界,2006,47(6):378-381

[11]许雅娟,赵艳景,胡虹.邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究[J].西南民族大学学报(自然科学版),2006,32(6):1207-1212