高效液相色谱波长切换法联合梯度洗脱法同时测定理气散结颗粒中6种成分的研究

王育，王毅，严亨波，魏谭军，李霞

(1.达州市食品药品检验所中药检测室，四川 达州 635000；2.达州市中西医结合医院制剂室，四川 达州 635000)

理气散结颗粒为达州市中西医结合医院的医院制剂，是经白芍、柴胡、延胡索等10味中药材提取浓缩成稠膏后加入适量辅料制成的颗粒剂。方中白芍柔肝平肝为君药，配以柴胡、延胡索疏肝解郁，可恢复肝正常的顺达之性，治疗肝郁血瘀之证。为有效控制理气散结颗粒的产品质量和疗效一致性，本文作者采用高效液相色谱(HPLC)波长切换法联合梯度洗脱法同时测定理气散结颗粒中的芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱，对理气散结颗粒的全面质量控制具有重要意义和应用价值。

1 仪器与试药

1.1仪器岛津LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司)；XS105DU分析天平(精度：0.01 mg，METTLER TOLEDO公司)；KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2试药与试剂对照品芍药苷(批号110736-201640，含量95.2%，2～10 ℃冷处保存)、柴胡皂苷a(批号110777-201510，含量93.2%，冷冻保存)、柴胡皂苷d(批号110778-201510，含量97.3%，冷冻保存)、延胡索乙素对照品(批号110726-201617，含量99.8%，2～10 ℃冷处保存)均来源于中国食品药品检定研究院；对照品去氢紫堇碱(批号30045-16-0，含量97.5%)来源于成都德思特生物技术有限公司；对照品紫堇碱(批号518-69-4，含量98.0%)来源于宝鸡市辰光生物科技有限公司；理气散结颗粒(每袋装15 g)来源于达州市中西医结合医院制剂室；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1供试品溶液的制备取本品内容物适量，混匀，研细，取约5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷至室温，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

2.2对照品溶液的制备分别精密称取芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱对照品各适量，用70%乙醇制成单一成分对照品储备溶液(芍药苷2.878 g·L-1、柴胡皂苷a 0.392 g·L-1、柴胡皂苷d 0.288 g·L-1、延胡索乙素0.272 g·L-1、去氢紫堇碱0.316 g·L-1、紫堇碱0.424 g·L-1)。依次精密量取各对照品储备液5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL和2.5 mL，定容至100 mL，用70%乙醇制成混合对照品溶液。

2.3三种阴性样品溶液的制备依据理气散结颗粒的处方和生产工艺，制备缺白芍阴性样品、缺柴胡阴性样品和缺延胡索阴性样品，依据供试品溶液制备方法制成白芍阴性样品溶液、柴胡阴性样品溶液和延胡索阴性样品溶液。

2.4色谱条件Agilent TC- C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脱(0～11 min，18.0%A；11～17 min，18.0%A→32.0%A；17～29 min，32.0%A→55.0%A；29～44 min，55.0%A→80.0%A；44～50 min，80.0%A→18.0%A)；0～17 min在230 nm[1-4]波长下检测芍药苷，17～29 min在210 nm[5-6]波长下检测柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，29～50 min在280 nm[7-11]波长下检测延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃。

2.5系统适用性及专属性试验取“2.1 供试品溶液”“2.2 对照品溶液”“2.3 三种阴性样品溶液”和空白溶剂，依法进样测定，记录色谱峰，各阴性样品溶液色谱图中，在所测芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱6种成分对应的位置处无干扰(图1)，理论塔板数按芍药苷计不低于3 500，分离度符合药典要求。

2.6线性关系考察精密量取芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱对照品储备液各0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分别置20 mL量瓶中，用70%乙醇定容，制成25倍浓度差的6种不同浓度混合对照品溶液，依法进样测定芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的峰面积，以芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的质量浓度(mg·L-1)为横坐标(x)，所测各成分的峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归(表1)。

表1 线性关系实验结果

2.7加样回收率试验分别精密称取芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱对照品各适量，用70%乙醇制成单一成分的加样对照品溶液(芍药苷0.761 g·L-1、柴胡皂苷a 0.539 g·L-1、柴胡皂苷d 0.409 g·L-1、延胡索乙素0.299 g·L-1、去氢紫堇碱0.431 g·L-1、紫堇碱0.247 g·L-1)。

称取已知含量批号为20160909的理气散结颗粒6份，每份约2.5 g，精密称定，分别精密加入上述各成分对照品溶液5.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、70%乙醇40 mL，按供试品溶液制备方法制备加样回收样品溶液，依法进样测定，计算芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱平均加样回收率及RSD值(表2)。

2.8精密度试验取“2.2”项下混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱峰面积的RSD(n=6)分别为0.62%、1.15%、0.72%、0.94%、1.18%和0.55%。

2.9重复性试验称取批号为20160909的理气散结颗粒6份，按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，依法进样测定，分别计算芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的含量，结果6种组分含量的RSD分别为1.22%、0.89%、1.39%、0.67%、0.43%和1.70%。

2.10稳定性试验取同一供试品溶液，分别于室温下0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h进样测定，结果供试品溶液室温下16 h内稳定，芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱峰面积的RSD分别为1.08%、0.65%、0.82%、0.96%、0.77%和1.31%。

2.11样品含量测定取3批次样品，依据供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法进样测定，结果见表3。

表3 理气散结颗粒样品含量测定结果/mg·g-1

3 讨论

3.1提取方法的选择在供试品溶液提取方法上，作者分别尝试了回流提取和超声提取，结果回流提取和超声提取所测6种成分芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的测定结果差异无统计学意义，选取操作简便的超声提取作为供试品溶液的提取方式；在此实验基础上，作者又考察了不同的超声提取时间(15 min、30 min、60 min)和提取溶剂(50%乙醇[1]、70%乙醇[8]、95%乙醇、甲醇[9])，结果超声提取15 min所测成分含量测定结果偏低，超声提取30 min和超声提取60 min，所测成分含量较高。以70%乙醇为提取溶剂时，所测各成分综合提取率最佳，故最终选取70%乙醇超声提取30 min作为理气散结颗粒供试品溶液的制备方法。

表2 理气散结颗粒回收率实验结果

3.2流动相的选择作者在本研究中分别对甲醇-水流动相体系[12]、乙腈-水流动相体系[13-14]、乙腈-0.1%磷酸溶液流动相体系[9,15-16]、乙腈-0.1%冰醋酸溶液流动相体系[6]进行了对比考察，以色谱峰基线平稳情况和所测成分芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的峰形及分离度为指标，优选最佳的流动相体系，结果以乙腈-0.1%冰醋酸溶液为流动相按照文中的梯度洗脱进行洗脱时，色谱峰基线平稳，所测各成分峰形较好，分离度符合中国药典规定。

3.3测定方法的选择理气散结颗粒为中药复方制剂，所含成分复杂，不同活性成分的最大吸收波长差异较大，单一波长难以同时测定多种活性成分的含量。本研究采用波长切换技术，提高了所测定成分的灵敏性和检测结果的准确性，同时联合梯度洗脱技术，提高了所测各成分的分离效果，缩短了检测时间，实现了对理气散结颗粒中芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱6种成分的同时测定。同时HPLC波长切换联合梯度洗脱法对中药复方制剂多成分同时测定存在对照品使用量较大、检测成本高等不足之处，采用一测多评法对理气散结颗粒中多成分同时测定还在进一步研究中。

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