施用氮磷肥料对小粒黑豆抗氧化活性的影响

宋艳丽，高小丽，张 鋆，赵 涛，黄贵斌，王睿豪，梁鸡保(.西北农林科技大学 农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 700;.神木县农业技术推广中心，陕西神木 79300)

小粒黑豆是豆科植物大豆[Glycinemax(L.)merr]的黑色种子，因其含有丰富的不饱和脂肪酸、氨基酸、黄酮、酚类物质、花色苷等[1-3]，具有护心保肝、抗癌抗衰、减肥益智等多种保健功效，是极具开发潜力的药食兼用植物资源[4-10]。小粒黑豆是中国黄土高原地区的主栽品种，在当地农业生产发展中占据重要地位[11]。近年来，黑色食品的保健功效受到广泛关注，而黑豆作为主要的黑色食品也备受关注。面对市场需求的多样性，生产满足需求的高品质黑豆成为发展黄土高原农业生产的关键，因此对小粒黑豆种质资源的鉴选利用和优质高效栽培技术的研究具有重要意义。

黄酮类化合物的合成主要通过苯丙烷途径，通过不同的前体物质在有关酶如苯丙氨酸解氨酶(PAL)或酪氨酸解氨酶(TAL)的作用下合成[12]。N、P矿质营养可以通过影响黄酮类物质合成途径有关酶的活性从而促进或抑制其合成[13]。黄酮、酚类物质及花色苷等是重要的抗氧化活性物质，能够与自由基反应清除自由基从而消除氧化作用，因此其含量的多少决定抗氧化能力的强弱[14-18]。李娟等[14]的研究表明，N营养能够调控青花菜中酚类物质的合成。刘伟[19]的研究表明，缺N、缺P均可通过影响酶的活性从而影响菊花中某些黄酮和酚类化合物含量的变化。有机肥较无机肥更有利于提高白芍中总酚类、类黄酮等的质量分数[20]。也有研究证实，重施氮肥能够降低薰衣草中酚类化合物的浓度[21]。

目前，国内外关于施肥对黑豆抗氧化活性影响的研究鲜有报道。本研究以未施N、P的黑豆为对照，对其他15种不同氮磷配比施肥处理的黑豆抗氧化活性进行分析。以总黄酮、总酚、总花色苷及自由基清除作用等作为试验指标，研究不同氮磷配比下小粒黑豆籽粒色差值(ΔE)、抗氧化物质、抗氧化能力及其三者之间的关系，为小粒黑豆种质资源的鉴选利用和优质高效栽培技术研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以神木‘连枷条’黑豆品种为供试材料，试验地设在陕西省神木县赵家沟旱作示范园内。供试土壤0～20 cm土层pH为8.25，速效氮6.59 mg·kg-1，速效磷15.52 mg·kg-1，有机质4.7 g·kg-1，前茬作物为糜子。

1.2 试验设计

试验设氮、磷2个因素(分别用尿素和磷酸钙肥折算)，4个水平，纯N分别为0、90、180、270 kg·hm-2，纯P2O5分别为0、180、360、540 kg·hm-2，共16个处理，64个小区，所有小区均覆盖地膜。小区面积30 m2(6 m×5 m),行距0.50 m，株距0.30 m，于5月上旬播种，每穴定苗1株，田间管理同大田生产，各处理施肥量见表1。各处理在10月中旬成熟后分区采收，籽粒脱壳后备用。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 提取液的制备 参考Prior等[22]和Korus等[23]方法制备提取液，-20 ℃保存备用。

1.3.2 总黄酮质量分数测定 参考 Jia等[24]方法。用芦丁制作标准曲线。样品中的总黄酮质量分数以芦丁计。

1.3.3 总酚质量分数测定 采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法测定。参考Xu等[25]方法。用没食子酸制作标准曲线。样品中的总酚质量分数以没食子酸计。

1.3.4 总花色苷质量分数测定 采用pH示差法测定。参考Jeng等[26]方法。样品中的总花色苷质量分数以矢车菊素-3-葡萄糖苷计。

1.3.5 ·OH清除作用 参考Li等[27]方法。

1.3.7 DPPH·清除作用 参考Xu等[25]方法。并将方法中的无水甲醇换为无水乙醇。

1.4 数据统计与处理

采用Excel 2007进行数据及图表处理，利用SPSS 19.0和SAS 8.1进行分析。

表1 各处理施肥量设计

2 结果与分析

2.1 不同N、P配比对小粒黑豆抗氧化物质的影响

2.1.1 对总黄酮和总酚质量分数的影响 由表2可以看出，未施N、P的小粒黑豆总黄酮质量分数为20.57 mg·g-1。施肥处理后，小粒黑豆的总黄酮质量分数显著升高。施N与施P均对小粒黑豆总黄酮质量分数有显著影响。不同N、P配比下，总黄酮质量分数差异显著，其中N0P2、N3P2总黄酮质量分数较高，分别为33.94和34.26 mg·g-1，较对照分别提高65.00%和66.55%。

不同N、P配比下的小粒黑豆总酚质量分数显示，施肥处理后的小粒黑豆总酚质量分数显著高于未施N、P的小粒黑豆，其中N0P2、N3P2总酚质量分数较高，分别为26.60和25.88 mg·g-1。

由表2也可以看出，在同一施N水平下，随着P肥的增多，小粒黑豆总黄酮与总酚质量分数均呈现先升高后降低的单峰变化趋势。而在N3施肥水平下，则呈现先下降后升高的趋势。在同一施P水平下，小粒黑豆黄酮与总酚质量分数的变化趋势略有差异。随着N肥的增多小粒黑豆总黄酮质量分数基本上呈现先降低后升高的单峰变化趋势，而在P0施肥水平下分别呈现持续上升趋势；总酚质量分数基本上呈现持续下降的趋势，而在P0、P2施肥水平下分别呈现持续上升、先降低后升高的趋势。

这可能是由于蛋白质竞争作用[29]的结果，N、P元素均影响蛋白质的合成，当蛋白质合成量不足以抑制苯丙氨酸代谢途径，酚类物质正常合成，呈现上升的趋势；当蛋白质合成量多时，酚类合成受到抑制，呈现下降趋势[30]。

2.1.2 对总花色苷质量分数的影响 由表2可以看出，不同的N、P配比中N1P2总花色苷质量分数最高，为1.27 mg·g-1，显著高于未施N、P小粒黑豆总花色苷质量分数。且除N2P0外，其他施肥处理下的小粒黑豆中总花色苷质量分数均显著低于N1P2。

2.2 不同N、P配比对抗氧化能力的影响

2.2.1 对·OH清除作用的影响 不同的N、P配比处理小粒黑豆全粉提取液对·OH清除能力如图1所示。小粒黑豆的·OH清除率均在70%以上，其中N3P0施肥处理小粒黑豆·OH清除能力最弱，为71.76%，甚至比未施N、P的小粒黑豆减少2.23%。而N3P2的·OH清除能力最强，达90.59%。

表2 不同N、P配比对小粒黑豆抗氧化物质的影响

注：1.同一列中不同字母表示有显著性差异(P≤0.05)。2.按每克干豆粉计算。3.总酚质量分数以没食子酸计，总黄酮质量分数以芦丁计，总花色苷质量分数以矢车菊素-3-葡萄糖苷计。

Note:1.Different letters in the same column indicated significant difference(P≤0.05).2.Calculated on the dry soybean meal per gram.3.Total phenol mass fraction measured in gallic acid,total flavonoids mass fraction in rutin,the total anthocyanin mass fraction in cyanidin-3-glucoside.

2.2.3 对DPPH·清除作用的影响 不同的N、P配比处理小粒黑豆全粉提取液对DPPH·清除能力如图3所示。未施N、P处理的DPPH·清除率最低，为84.62%，且显著低于其他施肥处理。而N2P0和N2P3的DPPH·清除率较高，分别为95.88%和94.86%。

图上不同字母表示有显著性差异(P≤0.05)，下同 Different letters indicate significant difference(P≤0.05),the same below

图2 不同N、P配比下清除能力

图3 不同N、P配比下DPPH·清除能力

2.3 不同N、P配比种植条件下小粒黑豆籽粒色差值(ΔE)、抗氧化物质与抗氧化能力的相关关系

表3 不同N、P配比小粒黑豆色差值(ΔE)、抗氧化物质、抗氧化能力相关性

注：*和**分别表示在0.05和0.01水平上显著相关。

Note:* and ** mean significant correlation at the 0.05 and 0.01 levels,respectively.

3 结论与讨论

不同氮磷配比对小粒黑豆抗氧化性有显著影响。N0P2、N3P2的总黄酮质量分数较高，分别较对照提高65.00%和66.55%。N0P2、N3P2的总酚质量分数较高，较对照高出59.00%和55.00%。N1P2的总花色苷质量分数最高，为1.27 mg·g-1，且显著高于对照。杨磊等[31]的研究表明，缺氮、缺磷处理能够提高山楂根系分泌液中的总黄酮质量分数。葛芳杰等[32]的研究表明，过高、过低的N、P胁迫均会导致穗花狐尾藻中酚类物质质量分数的升高。而Biesiada等[21]的研究表明，重氮施肥能够降低薰衣草酚类化合物的浓度。这与本研究结果基本一致。

结合不同N、P配比施肥处理对试验所涉及的抗氧化物质、抗氧化能力指标，综合认定每公顷施N 270 kg，P2O5360 kg；N 0 kg，P2O5360 kg；N 90 kg，P2O5360 kg分别为小粒黑豆高总黄酮质量分数、高总酚质量分数、高总花色苷质量分数的最佳施肥配比。因此，可以根据不同N、P肥料配比获得不同种类高抗氧化性小粒黑豆。

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