赤水晒醋中增黏微生物的分离鉴定及特性研究

杨 新，陈 莉，卢红梅，白成松，杨华连，杨双全*

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025）

食醋是以粮谷为原料经过糖化、酒精发酵、醋酸发酵而制成的含醋酸的液态酸味调味品[1]。其不仅作为一种调味品深受人们的喜爱，而且作为一种保健品被人们广泛食用。研究表明[2-7]，食醋具有促进食欲、保护胃肠道、抗菌杀菌、降血压、抗氧化、抗衰老、促进钙的吸收、预防骨质疏松、抗癌、防癌等功能。

赤水晒醋是贵州省赤水市生产的一种具有典型地方特色的优质食醋产品，其选料考究、制作精良、质量标准要求高，具有不可复制的独特性。传统的赤水晒醋工序繁多，精湛复杂，需要中草药制曲、大米精选、蒸煮、发酵、醋醅装坛曝晒、醋醅浸淋、产品精酿、灭菌等三十六道工序，整个生产周期在两、三年以上。由于传统的赤水晒醋酿造工艺周期长，产量低，难以满足市场需求，因此部分企业对传统工艺进行了改进，以缩短工艺周期，提高产量，但是工艺的改变也给产品质量带来了挑战，部分新工艺产品出现了产气、黏度增加等问题，不仅影响了产品质量安全，而且给企业信誉和形象造成了损害，而且类似问题在其他食醋企业中也时有发生。因此进行食醋中污染杂菌的相关研究成为食醋行业较为迫切的问题，这对于促进食醋行业的发展具有积极的意义。

本研究以出现黏度增加质量问题的赤水晒醋为研究对象，从中分离筛选出导致黏度增加的菌株，并对其进行验证，通过生理生化特征和16S rDNA基因序列分析对分离筛选所得到的菌株进行鉴定，并对分离筛选得到的菌株的生长特性进行研究，以期为食醋中杂菌的防治提供理论基础及参考，这对于保障赤水晒醋产品质量安全、减少企业经济损失具有切实的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

黏稠的晒醋（食醋A）、正常的晒醋（食醋B）：均由某赤水晒醋企业提供。

1.1.2 培养基

营养琼脂培养基：北京陆桥技术股份有限公司；LB液体培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH自然，121℃灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂

碘化钾、碘（均为分析纯）：贵州赛兰博科学仪器有限公司；氯化钠（分析纯）：成都临江化工厂；无水乙醇、体积分数为95%乙醇（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；刚果红、孔雀绿（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；番红（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、TaqDNA聚合酶、MgCl2（分析纯）：上海生工生物工程公司。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-5D S11立式压力蒸汽灭菌器、SN-CJ-IF洁净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SPX-250B智能型生化培养箱：上海琅玕实验设备有限公司；DMS-653广西生物数码显微镜：深圳市博宇仪器有限公司；∑IGMAZEISS电子扫描显微镜：北京普瑞赛司仪器有限公司；NDJ-1旋转黏度计：上海天平仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 微生物的分离、纯化

将食醋样品（食醋A）稀释成10-1，吸取稀释样品0.2 mL，涂布接种到营养琼脂培养基[8]，然后倒置于恒温培养箱中，30℃培养3～5 d，同时接种正常食醋（食醋B）到营养琼脂培养基中进行培养作为对照。

选择菌落数在3～30之间的平板，用营养琼脂培养基进行划线分离纯化，传代3次，并用相应的试管斜面培养基在4℃条件下保存备用[9]。

1.3.2 增黏微生物的筛选

配制LB液体培养基，调节pH值至3.5，分装到试管中灭菌，再将分离出的微生物接种到上述培养基中，30℃培养3～5 d，用旋转黏度计检测培养基的黏度[10]。同时，以不接种作为对照，计算其黏度增加百分比。

1.3.3 微生物形态观察以及生理生化测定

将分离出来的主要微生物进行菌落形态观察（形态、颜色、边缘、透明度等特征）以及个体形态观察（染色显微镜观察）。

参考《伯杰细菌鉴定手册》[11]和《常见细菌鉴定手册》[12]分别对获得的增黏微生物进行生理生化试验。生理生化试验包括：甲基红试验（methyl red，MR）、过氧化氢酶酶试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐试验、石蕊牛奶试验、葡萄糖发酵试验、木糖发酵试验、L-阿拉伯糖发酵试验、D-甘露醇发酵试验等，每种试验3个重复。

1.3.4 16S rDNA基因序列分析

（1）微生物总DNA的提取

利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）提取实验菌株的DNA，其具体步骤参见试剂盒的说明书。DNA提取产物保存于-20℃冰箱中[13]。

（2）PCR扩增16S rDNA

以提取的基因组DNA为模板，利用通用引物：正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3'）和反向引物1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。所有PCR均在25μL标准反应体系中进行。反应程序为95℃预变性5min；95℃变性50 s，56℃复性50 s，72℃延伸90 s，30个循环；最后于72℃延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测[13]。

（3）DNA测序

纯化后的目的基因送上海生工公司进行测序。测序结果采用Chromas软件参照正反序列图谱进行人工校正。

（4）系统发育树的构建

用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）将测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中与已知细菌的16S rDNA基因序列进行同源性分析，并用MEGA5.10软件的邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树，具体确定菌株的种属[14-15]。

1.3.5 微生物生长特性研究

活化菌种：将分离得到的菌株接种于装液量为100 mL/250 mL LB液体培养基中，于30℃培养24 h。

（1）最适生长温度

取活化菌液1mL接种于装液量为100mL/250mLLB液体培养基中，分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃温度梯度下，各个温度梯度下设置3个平行组，以空LB液体培养基为空白对照，120 r/min摇床培养24 h，然后用分光光度计测定各菌液的OD600nm值，通过测得的OD600nm值绘制各细菌的最适生长温度曲线图[16]。

（2）最适生长pH

取活化菌液1 mL接种于装液量为100 mL/250 mL LB液体培养基中，分别设置pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5、pH 9.5、pH 10.5，各pH梯度下设置3个平行组，以空LB液体培养基为空白对照，120 r/min摇床培养24 h，然后用分光光度计测定各菌液的OD600nm值，通过测得的OD600nm值绘制各细菌的最适生长pH曲线图[17]。

（3）最适生长NaCl含量

取活化菌液1 mL接种于装液量为100 mL/250 mL LB液体培养基中，分别设置NaCl含量为0、1%、2%、3%、5%、7%、9%、11%、13%，各NaCl浓度梯度下设置3个平行组，以空LB液体培养基为空白对照，120 r/min摇床培养24 h，然后用分光光度计测定各菌液的OD600nm值，通过测得的OD600nm值绘制各细菌的最适生长NaCl含量曲线图。

（4）微生物生长曲线

取活化菌液10 mL接种于装液量为300 mL/500 mL LB液体培养基中，每种菌株做3组平行实验，将其置于最适温度条件下，120r/min摇床培养，前16h每隔4h测定OD600nm值，之后每隔8 h测定OD600nm值，连续检测4 d。以未接菌种的同批次LB液体培养基作为空白对照[18]。1.3.6数据处理与分析

采用Origin 8.6、Excel 2016和Design-Expert等软件对实验数据进行处理，每个处理组进行3次平行试验。

2 结果与分析

2.1 微生物的分离、纯化结果

采用营养琼脂培养基在恒温培养箱中对样品进行培养，涂有食醋A样品的培养基中有微生物生长，食醋B样品中没有微生物长出。通过平板划线对分离得到菌种进行筛选纯化，共得到11株菌，分别命名为菌株N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11。

2.2 黏度增加微生物的验证结果

将筛选得到的11株菌株接种在LB液体培养基中，进行黏度测定，结果如表1所示。

表1 食醋黏度增加验证结果Table 1 Results of viscosity increment verification of vinegar

由表1可知，接种了菌株N1～N11的培养基黏度均有所增加，其中，接种了菌株N3、N5、N7和N11的培养基黏度增加很明显，增加了33.62%～39.66%；接种了其他的菌株的培养基的黏度幅度均＜15%。菌株N3、N5、N7和N11明显使食醋黏度增加，说明导致食醋黏度增加的主要菌株是N3、N5、N7和N11。

因此，对菌株N3、N5、N7、N11这4株菌株进行鉴定、分析，通过了解这4株菌的特性，从而控制这4株菌株的生长，更能有效地控制食醋黏稠增加的现象。

2.3 增黏微生物形态观察以及生理生化试验结果

菌株N3、N5、N7、N11的菌落及细胞形态见图1。

图1 菌株N3、N5、N7、N11菌落及细胞形态Fig.1 Colony and cell morphology of strains N3,N5,N7 and N11

由图1可知，菌株N3菌落呈乳白色，表面干燥褶皱，边缘整齐，易挑起，不透明，该菌株为杆状，长约1.50 μm，直径约0.72 μm。菌株N5菌落呈白色，表面湿润光滑，边缘呈放射状，易挑起，不透明，该菌株为杆状，呈现链状，长约1.68 μm，直径约0.76 μm。菌株N7菌落呈棕色，表面干燥不平滑，边缘不整齐，难挑起，不透明，该菌株为杆状，长约1.40 μm，直径约0.65 μm。菌株N11菌落呈棕黄色，表面湿润光滑，边缘整齐，易挑起，不透明，该菌株为杆状，长约1.24 μm，直径约0.73 μm。

按文献《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》分别对4株菌株进行生理生化测定，测定结果见表2。

表2 菌株生理生化试验结果Table 2 Results of physiological and biochemical tests of strains

续表

图2 菌株N3(A)、N5(B)、N7(C)和N11(D)基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strains N3(A),N5(B),N7(C)and N11(D)based on 16S rDNA sequence

由表2可知，菌株N3、N5、N7和N11的过氧化氢酶试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐试验、葡萄糖发酵试验、木糖发酵试验、L-阿拉伯糖发酵试验、D-甘露醇发酵试验呈阳性，石蕊牛奶试验呈阴性。同时菌株N3的甲基红试验（MR试验）也呈阳性，而菌株N5、N7和N11的甲基红试验（MR试验）呈阴性。通过对比《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》可知，菌株N3、N5、N7和N11均呈现芽孢杆菌属（Bacillussp.）的主要特征，其具体菌种有待进行分子鉴定。

2.4 16S rDNA基因序列分析及基因系统发育分析

采用16S rDNA测序方法对菌株N3、N5、N7和N11进行分子生物学鉴定，对DNA进行扩增检测，将检测结果输入美国国家生物技术信息中心（NCBI）进行基本局部比对搜索工具（BLAST）对比，采用邻接法（N-J）构建系统发育树，结果见图2。

由图2（A）可知，菌株N3的16SrDNA基因序列与Bacillus licheniformis的相似度最大，为100%。结合菌株N3的细胞形态、菌落形态及生理生化特征可以鉴定菌株N3为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。由图2（B）可知，菌株N5的16S rDNA基因序列与Bacillus amyloliquefaciens的相似度最大，为84%。结合菌株N5的细胞形态、菌落形态及生理生化特征可以鉴定菌株N5为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。由图2（C）可知，菌株N7的16S rDNA基因序列与Bacillus licheniformis的相似度最大，为99%。结合菌株N7的细胞形态、菌落形态及生理生化特征可以鉴定菌株N7为索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）。由图2 D）可知，菌株N11的16S rDNA基因序列与Bacillus acidicola的相似度最大，为100%。结合菌株N11的细胞形态、菌落形态及生理生化特征可以鉴定菌株N11为酸居芽孢杆菌（Bacillus acidicola）。

2.5 微生物生长特性的研究

2.5.1 菌株最适生长温度的确定

图3 温度对菌株N3、N5、N7和N11生长的影响Fig.3 Effect of temperature on the growth of strains N3,N5,N7 and N11

由图3可知，随着培养温度的上升，菌株N3、N5、N7、N11的OD600nm值均呈先增加后降低的趋势，在30～40℃温度范围内，OD600nm值上升比较缓慢；在40～45℃温度范围内，OD600nm值上升较快；当温度为45℃时，OD600nm值达到最大值，之后OD600nm值快速下降。因此菌株N3、N5、N7、N11的最适生长温度均为45℃。

2.5.2 pH值对微生物生长的影响

图4 pH值对菌株N3、N5、N7和N11生长的影响Fig.4 Effect of pH on the growth of strains N3,N5,N7 and N11

由图4可知，菌株N3、N5、N7、N11的OD600nm值随pH值的升高均呈先增加后降低的趋势，且分别在pH8.5、4.5、4.5和5.5时，OD600nm值达到最大值，因此，菌株N3、N5、N7、N11的最适pH值分别为8.5、4.5、4.5和5.5。

2.5.3 NaCl含量对微生物生长的影响

图5 NaCl含量对菌株N3、N5、N7和N11生长的影响Fig.5 Effect of NaCl content on the growth of strains N3,N5,N7 and N11

由图5可知，随着NaCl含量的增加，菌株N3、N5、N7、N11的OD600nm值呈先增加后降低的趋势，菌株N3、N7、N11的OD600nm值在NaCl含量为1%时达到最大值，而菌株N5的OD600nm值在NaCl含量在NaCl含量为2%时达到最大值，继续增加NaCl含量，菌株OD600nm值逐渐下降，当NaCl含量为7%时，菌株N7的OD600nm值为0；当NaCl含量为9%时，菌株N3、N5、N11的OD600nm值几乎为0。因此，菌株N3、N7、N11的最适生长NaCl含量均为1%；菌株N5的最适生长NaCl含量为2%。

2.5.4 微生物生长曲线

图6 菌株N3、N5、N7和N11的生长曲线Fig.6 Growth curves of strains N3,N5,N7 and N11

由图6可知，菌株N3、N5、N7和N11在LB液体培养基中的生长规律符合典型的S形生长曲线，在LB液体培养基中的延迟期都比较短，能够快速进入对数生长期。菌株N3、N5、N7和N11分别在30 h 、20 h、16 h和40 h后进入稳定期和衰亡期。因此菌株N3、N5、N7和N11具有较快的生长速度，对数期开始比较早。

综上所述，导致食醋黏稠增加的主要的微生物是几种耐热耐酸的芽孢杆菌。根据这些菌株特点，可以采取一些措施来进行防范，如杜绝生醋连日存放，配兑后的生醋立即灭菌，减少微生物在食醋中生长繁殖；避免总酸5 g/100 mL以下生醋存放过夜；过程交叉污染将导致胀桶杆菌增殖泛滥，交叉污染主要包括生熟醋交叉、好坏醋交叉、生产场所污染等，因此，工厂管理者应该加强对生产过程的质量管理、保证洁净的操作环境、养成良好的操作习惯，坚决杜绝交叉污染[19-21]。

3 结论

本研究在恒温培养箱中通过营养琼脂培养基对样品（食醋A）进行培养，经过划线分离纯化得到11株菌，经黏度增加验证试验，得到导致黏稠增加的4株主要菌株。通过其菌落菌株形态、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，鉴定菌株N3为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、菌株N5为解淀粉芽孢杆菌菌株（Bacillusamyloliquefaciens）、菌株N7为索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）、菌株N11为酸居芽孢杆菌（Bacillus acidicola）。4株菌的生长特性研究表明，其最适生长温度均为45℃；菌株N3、N5、N7、N11的最适生长pH值分别为8.5、4.5、4.5和5.5；菌株N3、N7、N11的最适生长盐度均为1%，菌株N5的最适生长盐度为2%；菌株N3、N5、N7、N11在LB液体培养基中均具有较快的生长速度和较强的繁殖能力。本研究结果为食醋中杂菌的防治提供了理论参考，对保障赤水晒醋产品质量安全、减少企业经济损失具有切实的意义。

[1]何国庆.食品发酵与酿造工艺学[M].北京：中国农业出版社，2011：249-256.

[2]肖 辉，刘丽娟，李冰宁，等.酿造食醋与配制食醋成分鉴别方法研究[J].食品工业科技，2016，37（17）：308-311，359.

[3]夏 婷，姚佳慧，郑 宇，等.传统食醋的抗氧化成分及功能研究进展[J].食品科学，2017，38（13）：285-290.

[4]沈志远.镇江香醋的营养保健和药用功能研究[J].食品科学，2005，26（8）：483-485.

[5]梅 辉.食醋的营养以及保健功能研究[J].现代食品，2017（22）：7-8，11.

[6]MIKIYA K.Enhancing effect of dietary vinegar on the intestinal absorption of calcium in ovariectomized rats[J].Biotechnol Biochem,1999,163(5):905-910.

[7]KONDO S,TAYAMA K.Antihypertensive effects of acetic acid and vinegar on spontaneously hypertensive rats[J].Biosci Biotechnol Biochem,2001,65(12):2690-2694.

[8]陈源源，牛丹丹，王正祥.一种快速鉴定细菌的方法[J].食品与发酵工业，2007，33（5）：29-31.

[9]王祝健，马海乐，崔恒林.醋醅中细菌菌株的分离鉴定及系统学分析[J].中国食品学报，2011，11（6）：170-176.

[10]崔 云.食醋返浑机理的研究[D].贵阳：贵州大学，2009.

[11]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：199-203.

[12]布坎南.伯杰细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，1984：57-63.

[13]周永治.食醋生产工艺流程[J].江苏调味副食品，2007，24（5）：24-26.

[14]倪峥飞，许 伟，窦文芳，等.镇江香醋固态发酵醋醅中微生物总DNA提取方法比较[J].微生物学报，2010，50（1）：119-125.

[15]周 莲，陈 莉，卢红梅，等.茅台地区酱香型酒糟中高温细菌的分离鉴定[J].中国酿造，2016，35（3）：61-65.

[16]诸葛健.工业微生物实验技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，1994：145-148.

[17]陈燕飞.pH对微生物的影响[J].太原师范学院学报：自然科学版，2009，8（3）：121-124.

[18]李勇昊，姜永生，周长海，等.响应面法优化里氏木霉Rut C-30产纤维素酶液体培养基[J].中国酿造，2012，31（4）：29-32.

[19]李盈颖，高 雯，周帼萍.山西老陈醋样品的污染微生物分析[J].食品科学，2016，37（12）：226-231.

[20]马净丽，钱 锋.解决食醋胀桶问题的探讨[J].中国酿造，2010，29（9）：123-127.

[21]王韵阳，张超英，闫志勇，等.大蒜食醋复方溶液对金黄色葡萄球菌杀灭效果的研究[J].中国消毒学杂志，2011，28（3）：289-290，294.