一株刺盘孢属菌的分类鉴定及转化孕酮和雄烯二酮的研究

张广求，段焰青，马慧宇，刘 赟，杜 刚*

（1.云南民族大学 电气信息工程学院云南 昆明 650500；2.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650202；3.云南烟草质量监督检测站，云南 昆明 650106；4.云南民族大学 民族药资源化学国家民族事务委员会教育部重点实验室，云南 昆明 650500）

甾体化合物又称类固醇化合物，是含有环戊烷多氢菲核化合物的总称，母核结构由三个六元环和一个五元环构成，甾体化合物随母核上取代官能团和环上氧化状态的差异，具有的特定的生理活性，常见的活性甾体类化合物包括性激素、肾上腺皮质激素、甾醇、胆汁酸、强心苷、甾体皂苷、甾体生物碱等[1]。

微生物转化甾体化合物具较好的选择性，在甾体药物的研究和生产中有重要的地位[2]，一些微生物转化过程已被成功地整合到甾体药物和关键中间体的生产中[3-4]，甾体的微生物转化类型包括羟基化、脱氧、氧化还原、环氧化等[5-7]。很多微生物菌株可实现甾体羟基化，如青霉菌、链霉菌、毛霉、曲霉、根霉、小克银汉霉等[8-11]。刺盘孢属菌株进行生物转化已有很多研究，ARUNRATTIYAKORN P等[12]以刺盘孢属菌株MAT02转化α-倒捻子素，获得新颖的转化产物；NUMPAQUE M A等[13]以尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）转化阿魏酸为4-乙烯基愈创木酚，产生香荚兰乙酮、香草醛和乙基愈创木酚等香味物质，WU Y等[14-15]在微生物转化甾体的研究中，亚麻刺盘孢菌株（Colletotrichum lini）ST-1可转化4-雄烯二酮（4-androstenedione，4-AD）为11α,15α-二羟基-4-雄烯二酮，转化孕酮为15α-羟基孕酮，转化睾酮为11α,15α-二羟基睾酮。以上研究，可得到甾体化合物多样化的衍生物，为甾体药物筛选和生产提供了技术支持。

寻找新的甾体转化菌株是甾体工业发展的重要课题，本研究从滇重楼根状茎中分离到一株能转化孕酮和4-AD的刺盘孢属菌株YNCA0116，并对其进行分类鉴定和转化研究，以期为研究和开发甾体药物提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株

转化菌株为实验室保藏菌株，分离自滇重楼根状茎，菌株实验室编号为YNCA0116。

1.1.2 试剂

孕酮和4-AD标准品（纯度＞98%）：江苏省盐城信谊医药化工有限公司；聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）试剂（琼脂糖、DNATaq酶Mix、引物ITS4、ITS5等）：上海生工生物工程技术服务有限公司。其他试剂均为分析纯：购自国药化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基：蔗糖2.0%，马铃薯20.0%，琼脂2.0%，pH自然。

种子培养基：蔗糖2.0%，马铃薯20.0%，pH自然。

孕酮或4-AD转化培养基为察氏培养基：NaNO30.3%，K2HPO40.1%，KCl 0.005%，MgSO4·7H2O 0.05%，蔗糖2.0%，孕酮或4-AD 0.1%，吐温-80 0.2%，pH自然。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-ZFD超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-40BI电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；HP-900恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；ZHWY-2102恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；AR224 CN电子天平：奥豪斯国际贸易上海有限公司；KS-600D超声波清洗器：宁波科胜仪器厂；RⅡ旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；Agilent 1100分析型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；XT-4熔点测定仪：上海华岩仪器设备有限公司；P-2000旋光仪：日本分光株氏会社；FTS-135红外光谱仪：美国Bio-Rad公司；240PC紫外分光光度仪：日本岛津公司；VG AutoSpec-3000质谱仪：英国VG公司；Bruker AV-400核磁共振仪：德国布鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株形态鉴定

形态学鉴定：以PDA培养基通过插片培养，对转化菌株进行形态特征观察，参考真菌鉴定手册[16]进行初步鉴定。

1.3.2 菌株分子鉴定

菌株的总DNA的提取用改良十六烷基三甲基溴化铵hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[17]，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量和浓度。PCR反应体系（25μL）：DNATaq酶Mix，10μL；引物ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，2 μL；引物ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，2 μL；模板DNA，2 μL；纯净水，9 μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸1.5min；72℃末端延伸10min；循环30次；4℃保存。

送Invitrogen公司进行测序，用Blast软件将测得的序列在GenBank数据库中进行相似性搜索，选用同源性比较高的典型菌株的ITS序列作为参比对象，采用邻接法用MEGA 7软件以ITS序列构建鉴定菌株与参比菌株的系统发育树。

1.3.3 放大发酵培养

取斜面培养基上的菌丝接种入5瓶种子培养基，置于恒温摇床，温度30℃，转速220 r/min，培养5 d。

各配制5 L孕酮和4-AD转化培养基：每250 mL锥形瓶加入100 mL培养基，经121℃灭菌锅灭菌冷却至室温，将每10 mL种子培养基接种入转化培养基，置于恒温摇床，温度30℃，转速220 r/min，发酵7 d。

1.3.4 转化产物的提取

发酵产物经减压抽滤，菌丝体用乙醇浸泡超声提取3次，过滤、合并乙醇浸提液，减压浓缩；滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩。合并上述粗提物，得到转化产物的总提取物。

1.3.5 高效液相色谱分析检测方法

色谱柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；检测器：二极管阵列检测器；流动相：甲醇∶水=41∶59（V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：243 nm；柱温：室温；进样量：5 μL。

1.3.6 转化产物的分离与鉴定

将转化产物提取物用甲醇溶解，利用硅胶柱层析进行分离，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯体系。转化孕酮粗提物用200～300目的硅胶拌样，通风橱下放置晾干，用200～300目硅胶柱层析，干法上样，用石油醚和乙酸乙酯的不同体积比进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比分别为：10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、0∶1，洗脱液浓缩真空抽干后用薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）检测分析法分析，相同组分合并。转化4-AD粗提物用200～300目硅胶柱层析，干法上样，用石油醚和乙酸乙酯的不同体积比进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比为：10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、0∶1，洗脱液浓缩真空抽干后，用TLC检测分析法分析，相同组分合并。参考WU Y等[14-15]的方法，将分离得到的化合物以核磁共振、红外光谱、质谱分析等手段进行结构解析。

2 结果与分析

2.1 转化菌株的形态学鉴定

以PDA培养基通过插片培养，对转化菌株进行形态特征观察，该菌的菌落及菌丝形态见图1。由菌株YNCA0116在PDA培养基生长5 d，菌落背面褐色、正面中间褐色边缘白色，菌丝分隔，菌丝生于基质内，PDA培养基未产生孢子，在促孢培养基上也未产生孢子。初步鉴定菌株YNCA0116为刺盘孢属（Colletotrichumsp.）。

图1 菌株YNCA0116菌落及菌丝显微形态Fig.1 Colony morphology and mycelium micromorphology of strainYNCA0116

2.2 菌株16S r RNA基因序列鉴定及系统发育分析

菌株的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。

图2 菌株YNCA0116 PCR扩增电泳图Fig.2 PCR amplification electrophoretogram of strain YNCA0116

由图2可知，菌株YNCA0116 PCR扩增的ITS序列片段长度介于500～750 bp。ITS序列测序后进行建树分析，结果见图3。结果表明，菌株YNCA0116与长直孢刺盘孢NR 145380.1ColletotrichumgigasporumCBS133266和KF687734.1Colletotrichum gigasporum CBS 181.52聚为一小簇，与多株刺盘孢属菌株聚为一大簇，与长直孢刺盘孢NR 145380.1Colletotrichum gigasporumCBS 133266和KF687734.1Colletotrichum gigasporumCBS181.52相似度为100%，因此确定转化菌株为刺盘孢属（Colletotrichumsp.）。

图3 菌株YNCA 0116的ITS序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain YNCA 0116 based on ITS sequence

2.3 高效液相色谱分析结果

对刺盘孢属菌株YNCA0116转化孕酮和4-AD发酵液的粗提物进行高效液相色谱（high performance liquid chromatogram，HPLC）分析，结果分别见图4和图5。

图4 无底物培养基（A）、孕酮标准品（B）及菌株YNCA 0116转化孕酮发酵液（C）的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of non-substrate medium(A),progesterone standard(B)and progesterone fermentation liquid biotransformed by strain YNCA 0116(C)

图5 4-AD标准品（A）及菌株YNCA 0116转化4-AD发酵液（B）的HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of 4-AD standard(A)and 4-AD fermentation liquid(B)biotransformed by strain YNCA 0116

由图4可知，无底物培养基发酵在1.332 min出现培养基发酵的背景峰，孕酮出峰时间为14.014 min，孕酮转化产物出现在3.685 min（峰Ⅰ）和3.969 min（峰Ⅱ），孕酮几乎完全转化。由图5可知，4-AD出峰时间为28.253min，4-AD主要产转化物出现在2.658 min（峰Ⅲ），4-AD几乎完全转化。

2.4 转化产物的结构鉴定

孕酮转化提取物分离纯化，得到化合物1和化合物2；4-AD转化提取物分离纯化，得到化合物3。化合物1、2和3经核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱分析，结构如图6。

图6 菌株YNCA 0116转化产物结构Fig.6 Structures of the transformation products of strain YNCA 0116

三种化合物的结构解析如下：

化合物1：白色粉末，易溶氯仿、吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]25=+11.30°（CHOH）D3熔程：230～240℃。紫外光谱最大吸收波长243 nm，红外光谱主要基团频率为3453cm-1、3132cm-1、2361cm-1、165cm-1、1456cm-1、1128cm-1。核磁共振碳谱化学位移为44.7（t，C-1），40.1（t，C-2），200.5（C=O，C-3），124.5（d，C-4），171.1（s，C-5），35.7（t，C-6），34.8（t，C-7），18.5（d，C-8），60.7（d，C-9），34.3 s，C-10），68.8（d，C-11），50.6（t，C-12），33.7（s，C-13），62.2 d，C-14），72.7（d，C-15），37.6（t，C-16），59.3（d，C-17），15.8 q，C-18），31.5（q，C-19），208.1（C=O，C-20），31.7（q，C-21）；核磁共振氢谱化学位移为5.74（1H，m，H-4），4.05（1H，m，H-11），4.06（1H，m，H-15），0.71（3H，s，H-18），1.16（3H，s，H-19），1.98（3H，s，H-21）。电喷雾质谱显示准分子离子峰质荷比为369[M+Na]+，分子式：C21H30O4。与文献[18-19]对照一致，鉴定其结构为：11α,15α-二羟基孕酮（11α,15α-dihydroxyprogesterone）。

化合物2：白色粒状晶体，无味，易溶氯仿、吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]25=+4.6°DCH3OH），熔程：246～250℃。紫外光谱最大吸收波长243nm，红外光谱主要基团频率为3 443 cm-1、3 373 cm-1、1 720 cm-1、1697cm-1、1659cm-1。核磁共振碳谱化学位移为39.4（t，C-1），37.7（t，C-2），200.8（C=O，C-3），127.2（d，C-4），168.0（s，C-5），73.3（d，C-6），44.4（t，C-7），20.3（d，C-8），59.1（d，C-9），28.5 s，C-10），69.0（d，C-11），50.6（t，C-12），39.2（s，C-13），55.5 d，C-14），31.4（t，C-15），23.1（t，C-16），63.3（d，C-17），18.5（q，C-18），24.3（q，C-19），208.5（C=O，C-20），34.5（q，C-21）；核磁共振氢谱化学位移为5.82（1H，m，H-4），4.11（1H，t，J=10.5Hz，H-11），4.35（1H，t，J=3Hz，H-6），0.66（3H，s，H-18），1.51（3H，s，H-19），1.91（3H，s，H-21）。质谱显示准分子离子峰质荷比为369[M+Na]+，与文献[20]对照一致，鉴定其结构为：6β,11α-二羟基孕酮（6β,11α-dihydroxyprogesterone）。

化合物3：白色粉末，易溶吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯、氯仿，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]2D8=+222±1°（CHCl3），熔程：221～222℃。紫外光谱最大吸收波长243 nm，红外光谱主要基团频率为3 388 cm-1、2 922 cm-1、1 736 cm-1、1 657 cm-1、1 302 cm-1。核磁共振氢谱化学位移为1.37（3H，s，H-18），1.39（3H，s，H-19），3.23（1H，m，H-15），3.21（1H，m，H-11），5.90（1H，s，H-4）。核磁共振碳谱化学位移为41.0（t，C-1），38.5（t，C-2），199.6（C=O，C-3），124.8（d，C-4），171.7（s，C-5），36.0（t，C-6），35.3（t，C-7），32.9（d，C-8），60.3（d，C-9），34.3（s，C-10），68.4（d，C-11），51.4（t，C-12），44.1（s，C-13），47.8（d，C-14），69.6（d，C-15），57.7（t，C-16），216.0（C=O，C-17），15.5（q，C-18），22.1（q，C-19），质谱显示准分子离子峰质荷比为339[M+Na]+，与文献[21]对照一致，鉴定其结构为：11β,15α-二羟基-4-雄烯二酮（11β,15α-dihydroxy-4-androstendione）。

3 结论

能转化孕酮和4-AD的菌株YNCA0116为刺盘孢属（Colletotrichumsp.）。

从菌株YNCA0116转化孕酮的HPLC分析可以看出，孕酮被大部分转化为11α,15α-二羟基孕酮，转化专一性较好，极少部分转化为6β,11α-二羟基孕酮。在HPLC图上几乎看不到底物，表明转化完全，以后的工作中将尝试用发酵罐进行转化研究。为实现更为专一的转化，需通过转化过程的优化，减少或消除6β,11α-二羟基孕酮的生成。

从菌株YNCA0116转化4-AD的HPLC分析可以看出，4-AD被大部分转化为11β,15α-二羟基-4-雄烯二酮，转化专一性较好，未分离出其它转化产物。在HPLC图上几乎看不到底物，表明转化完全，以后的工作中将尝试用发酵罐进行转化研究。

刺盘孢属菌株YNCA0116转化孕酮和4-AD都得到二羟基产物，引入15α羟基的立体选择性，但11位羟基化时，孕酮为α构型，4-AD为β构型。本研究尚需以该菌株对更多的甾体化合进行转化研究，并深入研究转化机理，以明确该菌株转化甾体化合物的特点，为甾体药物的研究和开发提供更多的选择。

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