浮游球衣菌S9产铁氧化酶发酵条件优化及酶学特性研究

郑 虹，张晓榕，吴晓梅，邓加聪*

（1.福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建 福清 350300；2.近海流域环境测控治理福建省高校重点实验室，福建 福清 350300）

铁锰氧化鞘细菌是一类具有氧化铁、锰能力的革兰氏阴性菌，是活性污泥中的主要菌群[1]。除了可用于生产生物可降解材料——聚-β-羟丁酸（poly-β-hydroxybutyrate，PHB）外，在贵重金属和有毒金属的富集及生物监测和环境评价[2-6]等方面都有广阔的应用前景。

铁氧化酶和锰氧化酶是铁锰氧化鞘细菌在污水治理中的重要酶类[7-8]，它们能够降解污水中的有机物质和一些毒性物质；将可溶性的Fe2+、Mn2+氧化成Fe（OH）3和MnO2等不溶态的铁锰化合物，之后经沉淀过滤，除去水中的铁和锰，从而改善水体[9]。该方法简便、有效、经济，且不需投加药物，避免造成二次污染。

由于鞘细菌铁氧化酶产率较低，且活性不稳定，对铁氧化酶的分离纯化具有一定的难度，因此国内外对菌株所产铁氧化酶[10-11]的研究较少，很多学者主要集中在对菌株的筛选鉴定[12-13]、菌株在环境治理方面[3，6，14]的应用。汪令翔等[12]从活性污泥中筛选到一株产铁氧化酶菌株，对该菌株进行菌落形态、镜检、生理生化及16S rDNA基因的遗传分析，并对该菌株的最适温度、pH及金属离子进行研究。研究结果表明，将该菌株命名为假单胞菌GS8，该菌株的最适温度和pH范围分别为30℃和6.5～7.5，K+与Mg2+对铁氧化酶活性有一定的激活作用，Pb2+与Ag+对铁氧化酶活性有一定的抑制作用，而以Zn2+对铁氧化酶的抑制作用表现最强。本研究前期筛选到一株具有铁氧化酶活性的菌株——浮游球衣菌S9[15]，通过改良后的邻菲罗啉法[16-17]对菌株的产酶发酵条件及酶学特性进行研究，旨在为浮游球衣菌S9铁氧化酶的生产与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

浮游球衣菌（Sphaerotilus natans）S9：福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院微生物实验室。

1.1.2 化学试剂

硫酸镁、磷酸氢二钾、尿素、葡萄糖、硫酸铵、硝酸钠、柠檬酸铁铵、邻菲罗啉、蛋白胨、酵母膏、甘油（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

CGY培养基斜面培养基：蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，甘油10 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0。

尿素培养基：尿素0.5 g/L，葡萄糖 1 g/L，MgSO·47H2O 0.05 g/L，K2HPO40.1 g/L，自然pH。

基础发酵培养基：（NH4）2SO40.5 g/L，NaNO30.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO·47H2O 0.5 g/L，CaCl·26H2O 0.1 g/L，柠檬酸铁铵10 g/L，pH 7.0。

以上培养基在121℃条件下湿热灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

LDZX-40B1型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；BS224S电子天平：赛多利斯仪器系统有限公司；FA2204B型电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司；H1850R台式高速冷冻离心机：上海湘仪离心机有限公司；THZ-25大容量恒温振荡器：太仓市华美生化仪器厂；SPX-15OB-Z型生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；WFJ-7200型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对菌株S9产铁氧化酶影响的单因素试验

（1）碳源种类：按3%的接种量将种子液接种于添加不同碳源（葡萄糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉、柠檬酸钠）的发酵培养基，这些碳源代替基础发酵培养基中的柠檬酸铁铵，每种碳源的添加量为1%，30℃、150 r/min振荡培养72 h，测定发酵液的铁氧化酶活性。

（2）柠檬酸铁铵添加量：按3%的接种量将种子液接种于添加不同浓度（0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%）柠檬酸铁铵的发酵培养基，30℃、150 r/min振荡培养72 h，测定发酵液的铁氧化酶活性。

（3）氮源种类：按3%的接种量将种子液接种于添加不同氮源（硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素）的发酵培养基，这些氮源代替基础发酵培养基中的硝酸钠和硫酸铵，每种氮源的添加量为0.1%，30℃、150 r/min振荡培养72 h，测定发酵液的铁氧化酶活性。

（4）氯化铵添加量：按3%的接种量将种子液接种于不同氯化铵添加量（0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150%）的发酵培养基，30℃、150 r/min振荡培养72 h，测定发酵液的铁氧化酶活性。

（5）初始pH：按3%的接种量将种子液接种于不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）的发酵培养基，30 ℃、150 r/min振荡培养72 h，测定发酵液的铁氧化酶活性。

（6）培养时间：按3%的接种量将种子液接种于发酵培养基，30℃、150 r/min振荡培养24 h后，每隔12 h取样测定发酵液的铁氧化酶活性，取样时间为24 h、36 h、48 h、56 h、64 h、72 h、84 h、96 h。

（7）装液量：按3%的接种量将种子液接种于不同装液量（25mL/250mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL）的发酵培养基，30℃、150r/min振荡培养84h，测定发酵液的铁氧化酶活性。

（8）培养温度：按3%的接种量将种子液接种于发酵培养基，不同温度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、150 r/min条件下振荡培养84 h，测定发酵液的铁氧化酶活性。

1.3.2 对菌株S9产铁氧化酶影响的正交试验

根据单因素试验结果，以柠檬酸铁铵、氯化铵、初始pH、培养时间、装液量及培养温度作为考察因素，铁氧化酶活性作为考察指标，选用L18（36）正交表，进行产酶条件优化正交设计试验，因素与水平见表1。

表1 产酶条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme-producing conditions optimization

1.3.3 铁氧化酶活性的酶学特性研究

发酵液4℃、8 000 r/min离心10 min，除去沉淀，上清液备用。

（1）温度对酶活性的影响：取5mL上清液于不同温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）条件下保温30 min，测定样品的铁氧化酶酶活。

（2）pH对酶活性的影响：取5 mL上清液用0.5 mol/L的氢氧化钠和0.5 mol/L的盐酸将其pH分别调至（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5），室温下放置30min，测定样品的铁氧化酶酶活。

（3）金属离子对酶活性的影响：5 mL上清液中分别添加不同金属（MnCl2、NaCl、MgCl2、ZnCl2、KCl、PbNO3、CuCl2、AgNO3），使离子的终浓度达到5 mmol/L。30 min后测定样品的铁氧化酶酶活。

1.3.4 铁氧化酶活力的测定方法[16-17]

铁氧化酶活力的大小以该酶对二价铁离子的氧化率来表示，氧化率越高表明酶的活性越高。具体操作方法如下：

将发酵液于4℃、8 000 r/min离心5 min，其上清液为粗酶液。按顺序加入以下试液于试管中：1mL质量浓度为4.0g/L的FeSO4，1 mL 0.02 mol/L pH 6.5磷酸缓冲液，8 mL粗酶液。摇匀后放入30℃水浴锅中保温30 min。然后将反应液移入100 mL容量瓶中，再加10 mL 0.02 mol/L pH 5.0醋酸钠缓冲液，摇匀后加10 mL 0.1%邻啡啰啉溶液，静置10 min后于8 000 r/min、4℃离心 5 min，以水为参比，测OD510nm值。铁氧化率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 发酵产酶条件研究

2.1.1 不同碳源对菌株S9产铁氧化酶的影响

图1 不同的碳源对菌株S9产铁氧化酶的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on ferroxidase produced by strain S9

由图1可知，菌株S9可利用一些简单的化合物，如醇、糖类物质等，不同碳源对菌株S9铁氧化酶具有一定的影响，添加有柠檬酸铁铵＞可溶性淀粉＞甘油＞蔗糖＞柠檬酸钠＞葡萄糖，当柠檬酸铁铵为碳源时，该菌株的铁氧化率可达53.92%。可能因为柠檬酸铁铵中含有一定的铁离子，对于鞘细菌的生长具有促进的作用。因此，选择柠檬酸铁铵作为最佳碳源。

2.1.2 柠檬酸铁铵添加量对菌株S9产铁氧化酶的影响

由图2可知，柠檬酸铁铵的添加量对菌株铁氧化酶的影响较大，菌株铁氧化酶随柠檬酸铁铵添加量的增加呈先增后减的趋势。当柠檬酸铁铵添加量＜1.0%时，铁氧化率和相对酶活随着柠檬酸铁铵的增加而增强；当柠檬酸铁铵添加量为1.0%时，菌株的铁氧化率和相对酶活均达到最大值，分别为58.32%和100%；当柠檬酸铁铵添加量＞1.0%时，铁氧化率和相对酶活随着柠檬酸铁铵的增加而减弱。柠檬酸铁铵作为鞘细菌的最适碳源，低浓度或高浓度的柠檬酸铁铵都不利于菌株的生长，进而影响菌株产铁氧化酶的活性。因此，最佳柠檬酸铁铵添加量为1.0%。柠檬酸铁铵添加量的这个结果跟江令翔等[12]的研究结果一致。

图2 柠檬酸铁铵添加量对菌株S9产铁氧化酶的影响Fig.2 Effect of ferric ammonium citrate adtion on ferroxidase produced by strain S9

2.1.3 不同氮源对菌株S9产铁氧化酶的影响

图3 不同的氮源对菌株S9产铁氧化酶的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on ferroxidase produced by strain S9

由图3可知，不同氮源对菌株S9产铁氧化酶的影响各不相同，氯化铵＞（硫酸铵0.05%+硝酸钠0.05%）＞硝酸钠＞硫酸铵＞尿素，当氮源为氯化铵时，菌株的铁氧化率最强，其铁氧化率为65.41%。因此，选择氯化铵（NH4Cl）作为最适氮源。

2.1.4 氯化铵添加量对菌株S9产铁氧化酶的影响

图4 氯化铵添加量对菌株S9产铁氧化酶的影响Fig.4 Effect of ammonium chloride addition on ferroxidase produced by strain S9

由图4可知，菌株S9铁氧化酶先随着NH4Cl添加量的增加而增加，当NH4Cl添加量为0.10%时，其氧化率和相对酶活均达到最大，分别为60.44%和100%；之后发酵液的铁氧化率随着NH4Cl浓度的增加反而减少。低浓度的氯化铵对菌株铁氧化酶的产量有促进作用，而高浓度的氯化铵有抑制作用。因此，最佳NH4Cl添加量为0.10%。

2.1.5 培养基初始pH对菌株S9产铁氧化酶的影响

图5 初始pH对菌株S9产铁氧化酶的影响Fig.5 Effect of initial pH on ferroxidase produced by strain S9

由图5可知，菌株S9的适宜生长的pH范围为6.5～7.5，菌株S9在初始pH值为7.0时酶活力最高，其铁氧化率可达到64.89%，而当初始pH＞7.5或初始pH＜6.5时，其相对酶活均已下降至80%以下。太高或太低的初始pH不利于菌株的生长，进而影响到菌株产铁氧化酶的能力。因此，菌株S9的最适生长的初始pH值为7.0。

2.1.6 培养时间对菌株S9产铁氧化酶的影响

据文献报道[18]，浮游球衣菌的延迟生长期为1～2 d，对数生长期为3～5 d，稳定生长期为5～9 d，衰亡期为10 d之后。由图6可知，菌株S9的铁氧化酶随培养时间的延长呈先增后减的趋势；当培养时间为84 h时，此时菌株已进入生长对数期，菌株的铁氧化酶活性达到最高，其氧化率为68.58%。因此，选择培养84 h为最佳发酵培养时间。

图6 培养时间对菌株S9产铁氧化酶的影响Fig.6 Effect of culture time on ferroxidase produced by strain S9

2.1.7 培养基装液量对菌株S9产铁氧化酶的影响

图7 不同装液量对菌株S9产铁氧化酶的影响Fig.7 Effect of liquid volume on ferroxidase produced by strain S9

由图7可知，菌株S9的铁氧化率随着装液量的增加呈先增后减的趋势，当装液量为50 mL/250 mL时，其铁氧化率达到最高，为66.22%。装液量太低，不能为菌体提供足够的营养物质，对菌体的生长不利，进而不利于铁氧化酶的合成和积累；而装液量太高，发酵液中的溶氧量太低，不利于菌株的生长，也会影响菌株合成和积累铁氧化酶。因此，最适装液量为50 mL/250 mL。

2.1.8 培养温度对菌株S9产铁氧化酶的影响

图8 培养温度对菌株S9产铁氧化酶的影响Fig.8 Effect of culture temperature on ferroxidase produced by strain S9

由图8可知，不同培养温度对菌株产酶有一定的影响，温度对菌株S9产铁氧化酶的影响呈先增后降的趋势；当培养温度为30℃时，发酵液的铁氧化率达到最大值，为71.25%，培养温度＜28℃或培养温度＞32℃时，发酵液中铁氧化酶的相对酶活都低于40%。因此选择30℃为其最适发酵培养温度。

2.2 产酶条件优化正交试验结果

以柠檬酸铁铵、氯化铵、初始pH、培养时间、装液量及培养温度作为考察因素，以铁氧化率作为考察指标，选用L18（36）正交表，进行18个试验分析这6个因素对酶活力的影响。结果与分析见表2。

表2 产酶条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme-producing conditions optimization

由表2可知，各因素对菌株产铁氧化酶的影响主次顺序为柠檬酸铁铵添加量＞培养温度＞初始pH＞培养时间＞装液量＞氯化铵添加量，最佳发酵培养条件的组合为A2B2C2D2E3F2，即柠檬酸铁铵添加量1.0%，氯化铵添加量0.1%，初始pH值为7.0，培养时间84h，瓶装量75mL/250mL，培养温度30℃。在此优化条件下进行3次验证试验，发酵液中铁氧化率可达75.25%，与未优化前发酵液中铁氧化率提高了42.28%。

2.3 铁氧化酶的酶学性质研究

2.3.1 不同作用温度对酶活性的影响

图9 不同温度对铁氧化酶活性的影响Fig.9 Effects of different temperatures on ferroxidase activity

由图9可知，菌株S9产铁氧化酶的活性先是随着作用温度的升高而升高；当作用温度达到30℃时，处理液中铁氧化酶活性达到最高，其氧化率为53.62%；之后，铁氧化酶活性随着作用温度的升高反而降低，当铁氧化酶在50℃条件下保温30 min后，其氧化率已降至15.64%。因此，铁氧化酶的最适温度为30℃。

2.3.2 不同pH对酶活性的影响

图10 不同pH对铁氧化酶活性的影响Fig.10 Effects of different pH on ferroxidase activity

由图10可知，铁氧化酶的酶活先是随pH的升高而升高，之后又随着pH的升高而降低；酶活的较适pH为7～8，当pH 7.5时，酶的氧化率仍可达65.26%。因此，铁氧化酶的最适pH为7.5。

2.3.3 不同金属离子对酶活性的影响

由图11可知，不同金属离子对菌株产铁氧化酶的活性影响各不相同，各金属离子对铁氧化酶活性的影响如下：Mg2+＞Na+＞K+＞Cu2+＞Pb2+＞Ag+＞Zn2+＞Mn2+，其中Mg2+、K+、Na+对酶的活性具有增强作用，而Pb2+、Ag+会抑制酶的部分活性，Mn2+、Zn2+对酶具有很强的抑制作用。

图11 不同金属离子对铁氧化酶活性的影响Fig.11 Effects of different metal ions on ferroxidase activity

3 结论

浮游球衣菌是一类丝状细菌，是活性污泥中净化水体的主要菌群。培养因素和培养条件对菌株S9产铁氧化酶具有较大的影响。本研究对鞘细菌S9产铁氧化酶的培养条件进行优化研究，通过单因素试验和正交试验设计，确定最适产酶发酵培养基：柠檬酸铁铵1.0%，NH4Cl 0.1%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·6H2O 0.01%；最佳发酵条件为：培养初始pH7.0，培养温度30℃，装液量50 mL/250 mL，转速150 r/min，培养时间84 h。在此优化条件下，鞘细菌S9产生铁氧化酶的氧化活性高达75.25%，与未优化前发酵液中铁氧化率提高了42.28%。同时研究发现该菌株所产铁氧化酶的最适温度为30℃，最适pH值为7.5，Mg2+、K+、Na+对酶的活性具有增强作用，而Pb2+、Ag+会抑制酶的部分活性，Mn2+、Zn2+对酶具有很强的抑制作用。

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