乙酰辅酶A含量对酿酒酵母乙酸乙酯合成的影响

郑 楠，郭庆焕，何亚辉，钱 泓，赵 东，陈叶福*，郭学武，肖冬光

（1.天津科技大学 生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；2.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室，四川 宜宾 644000）

白酒是世界六大著名蒸馏酒之一，历史可追溯至数千年。白酒中的微量风味物质是影响白酒品质的主要因素，约占1%～2%，其中酯类物质又占微量成分的60%～90%，因此提高白酒的酯含量对于形成白酒风味典型性具有非常重要的意义[1-2]。乙酸乙酯是清香型白酒的主体香味成分，适量的乙酸乙酯能够使得酒体丰满、柔和、香味协调，其含量的高低直接决定清香型白酒品质的好坏。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）是白酒酿造过程中重要的发酵微生物，但产乙酸乙酯较少，清香型白酒中生成乙酸乙酯的主要微生物是产酯酵母，但产酯酵母产酒精能力弱，增加粮耗，且大多数为好氧微生物，液态发酵会阻止产酯作用的进行，因此通过改造酿酒酵母提高乙酸乙酯产量具有重要意义。研究表明[3]，酵母合成乙酸酯类有两种途径，一种是在酵母自身所含有的少量酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯；另一种是乙醇和酰基辅酶A在醇酰基转移酶的作用下在酿酒酵母细胞内生物催化生成相应的酯类，这是酿酒酵母中乙酸酯类的主要合成途径。对于液体发酵，乙酸乙酯的形成依赖于底物乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）、乙醇的浓度和醇乙酰基转移酶的活性。

乙酰辅酶A是工业生产上合成胆固醇、酮体和脂质等许多重要产品的前体物。在酿酒酵母中，不同的细胞区隔，如线粒体、胞液和过氧化物酶体中均能产生乙酰辅酶A。在胞液中，丙酮酸经过丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶的催化作用形成乙酰辅酶A。乙酰辅酶A合成酶（acetyl coenzyme A synthetase，ACS）基因由ACS1和ACS2两个基因编码[4]。乙酰辅酶A水解酶（acetyl coenzyme Ahydrolase，ACH）由ACH1基因编码，催化乙酰辅酶A水解为乙酸和辅酶A，可参与细胞内乙酰辅酶A调节[5]。

目前国内外学者提高乙酸乙酯的含量主要是通过筛选高产乙酸乙酯菌株[6]或者利用基因工程手段过表达醇酰基转移酶（alcohol acyltransferase，ATF）基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1[7-11]。DONG J等[12]通过调节ATF1基因的启动子强度使白酒中乙酸乙酯的含量提高了3.1倍。ZHANG C Y等[13]在工业啤酒酵母中通过转化多拷贝质粒过表达ATF1基因，使乙酸乙酯的产量增加为原来的9倍。提高醇酰基转移酶能够在一定程度上提高乙酸乙酯的生成量，但其限制因素还包括底物乙酰辅酶A和乙醇的浓度，酿酒酵母进行酒精发酵会产生充足的乙醇，所以乙酰辅酶A的含量是最根本的限制因素。综上，通过提高底物乙酰辅酶A的含量来提高乙酸乙酯生成量是一个可行的思路。同时，也为其他以乙酰辅酶A为底物的产品生产奠定了基础。因此，本研究通过敲除ACH1基因降低乙酰辅酶A的分解，过表达ACS1和ACS2基因增强乙酰辅酶A合成酶的活性，过表达ATF1基因提高底物乙酰辅酶A含量，进而提高乙酸乙酯的生成量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY15的单倍体菌株α5：天津科技大学天津市工业微生物重点实验室保藏；游离表达质粒Yep352、过表达ATF1基因的质粒PABBK和带有酿酒酵母磷酸甘油激酶基因（PGK1）强启动子的质粒Yep-PGK1、pGAPza质粒：本实验室保藏；质粒pUG6：德国Hegemann教授惠赠。ACS1/ACS2基因来自于酿酒酵母α5。

1.1.2 培养基及培养条件

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。

LB培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L。

以上两种培养基，自然pH值，固体培养基加2%琼脂，121℃灭菌15 min。

半乳糖诱导液态培养基：半乳糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，121℃灭菌15min。

一级种子培养基：糖度为8°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。

二级种子培养基：糖度为12°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。

发酵培养基：60 g玉米粉按1∶3（g∶mL）的料液比加水，70℃糊化20 min，加30 μL淀粉酶85～90℃液化90 min，加适量营养盐和酸性蛋白酶及90 μL糖化酶55～60℃糖化20 min后制得。

1.1.3 试剂和酶

淀粉酶（29万U/mL）、糖化酶（10万U/mL）：诺维信生物技术有限公司；酸性蛋白酶（10万U/mL）：尤特尔生化有限公司；苹果酸脱氢酶（1200U/mg）、柠檬酸合酶（1000U/mg）、限制性内切酶（10 U/μL）、rTaq聚合酶（5 U/μL）、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）连接酶（350 U/μL）、博来霉素（Zeocin）、遗传霉素（G418）、Rever TraAceRqPCR RT Kit：宝生物工程（大连）有限公司；卡那霉素抗性基因（KanMX）：德国Merck公司；酵母基因组DNA提取试剂盒、酵母核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；引物：金唯智生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

PCT-200型聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增仪、DYY-4c型电泳仪：美国BIO-RAD公司；Reference-2型移液枪：法国吉尔森公司；7890型气相色谱（gas chromatography，GC）仪、1260型号高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦科技有限公司；StepOnePlusTM实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）仪：美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 突变菌株的构建

（1）引物设计

根据GenBank中ACH1、ACS1、ACS2和ATF1基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0软件设计PCR反应引物见表1。所有引物均由金唯智生物科技有限公司合成，酶切位点以下划线表示。

表1 试验所用PCR引物Table 1 PCR primers used in the study

续表

（2）重组质粒Yep-PAK1、Yep-PAK2和Yep-ATF1的构建

根据美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）公布的S.cerevisiaeS288c的ACS1和ACS2基因序列，以酿酒酵母α5的基因组为模板，用引物ACS1-U/ACS1-D、ACS2-U/ACS2-D分别PCR扩增ACS1和ACS2基因片段，使用XhoI对质粒Yep-PGK1、ACS1及ACS2基因片段进行酶切、连接，构建重组质粒Yep-PA1和Yep-PA2。用引物K-U/K-D扩增质粒pUG6中的KanMX基因片段，再使用SphI对KanMX基因片段和质粒Yep-PA1、Yep-PA2进行酶切、连接，构建重组质粒Yep-PAK1和Yep-PAK2，构建流程如图1（a）所示。

以本实验室构建好的质粒PABBK为模板，PGK1-U和KAN-D为引物，PCR扩增得到4 877 bp的PGK1P-ATF1-PGK1T-KanMX基因条带，用SmaI酶切Yep352质粒和PGK1PATF1-PGK1T-KanMX基因连接，得到重组质粒Yep-ATF1，构建流程如图1（b）所示。

图1 重组质粒Yep-PAK和Yep-ATF1的构建Fig.1 Construction of recombined plasmids Yep-PAK and Yep-ATF1

（3）ACH1基因缺失突变株α5ΔACH1的构建

利用长引物法构建ACH1基因缺失突变株，在ACH1的5′和3′端分别取64 bp和63 bp的同源序列AA和AB，添加到扩增筛选标记KanMX片段的上下游引物K-U和K-D的5′端，构成长引物AK-U和BK-D，从pUG6质粒中扩增具有同源序列的AA-KanMX-AB片段。经醋酸锂化学转化法导入到酵母单倍体菌株α5中，转化后的细胞涂布于含有1000μg/mL G418的YEPD平板上进行筛选，PCR验证。

（4）过表达ACS基因突变株α5-A的构建

为分别实现ACS1及ACS2基因的整合过表达，以基因ACH1作为替代位点，实现ACS1及ACS2基因过表达的同时ACH1基因的敲除。分别以重组质粒Yep-PAK1和Yep-PAK2为模板，利用长引物AP-U和BK-D，分别PCR扩增得到重组片段AA-PGK1P-ACS1-PGK1T-KanMX-AB及AA-PGK1P-ACS2-PGK1T-KanMX-AB。经醋酸锂化学转化法导入到酵母单倍体菌株α5中，使AA和AB两个片段与酵母基因组上ACH1基因两侧的同源序列发生同源重组，如图2所示。转化后的细胞涂布于含有1 000 μg/mL G418的YEPD平板上进行筛选，挑取转化子并提取酵母基因组，以引物A-U和A′-D，B-U和B-D进行定点上下游定点验证。得到过表达ACS基因突变株α5-A1和α5-A2。

图2 重组片段的同源重组过程Fig.2 Process of homologous recombination of recombination fragment

（5）过表达ATF1基因突变株的构建

为了在α5△ACH1、α5-A1和α5-A2这3个菌株中过表达ATF1基因，需要再次利用KanMX抗性基因作为遗传标记，并且利用G418筛选转化子，所以需将3个突变株中KanMX基因敲除。Cre/loxP报告基因挽救系统能够实现上述剔除重组菌株标记基因KanMX的目的。因为本研究所采用的KanMX表达盒两端带有两个同向的重复序列loxP，利用pGAPza质粒上Cre重组酶基因可以识别两个loxP位点，切除中间的连接部分，再把两个loxP位点的剩余部分连接在一起，从而实现KanMX筛选标记的敲除。

筛选标记的去除：将pGAPza质粒用醋酸锂化学转化到含有KanMX抗性基因的酿酒酵母菌株中，涂布于含100μg/mL的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培养36 h。挑取长势较好的菌落接入到半乳糖诱导液态培养基中培养4～5 h，稀释涂布在YEPD平板上。挑出单菌落点接于YEPD上，再影印到含有G418抗性的YEPD平板上。在YEPD上生长而在含有G418的平板上不生长的菌株即为KanMX抗性基因敲除的菌株。提取酵母基因组，并通过PCR验证KanMX抗性基因是否敲除。

过表达ATF1基因突变株的构建：去除重组菌α5ΔACH1，α5-A1和α5-A2中的KanMX筛选标记，得到重组菌α5ΔACH1-K，α5-A1-K和α5-A2-K。将构建好的Yep-ATF1质粒用醋酸锂转化法导入α5中，α5ΔACH1-K，α5-A1-K和α5-A2-K中，挑取转化子验证，得到重组菌株α5-ATF1、ΔA-ATF1、A1-ATF1及A2-ATF1。

1.3.2 实时荧光定量PCR

基因ACS1和ACS2的表达水平采用实时荧光定量定量聚合酶链反应（RT-FQ-PCR）测定。重组菌株α5-A1和α5-A2 30℃液体培养12 h。用酵母RNA试剂盒提取信使RNA（mRNA），以mRNA为模板，采用反转录试剂盒合成互补脱氧核糖核酸（complementaryDNA，cDNA），以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR反应条件：95℃，5s；60℃，30s；72℃，45s；40个循环。以肌动蛋白基因（ACT1）为内参基因，合成引物ACS1-F/ACS1-R、ACS2-F/ACS2-R和ACT1-F/ACT1-R（见表1）。

1.3.3 生长曲线的测定

本实验采用比浊法测定菌体的生长曲线。从YEPD斜面上挑取1环酵母菌接入装液量为50 mL/250 mL YEPD中，30℃静置培养12 h。然后按照10%的比例接入装液量为100 mL/500 mL YEPD的三角瓶中，30℃静置培养，每隔2 h取出1 mL菌液，5 000 r/min离心5 min，弃清液，蒸馏水洗涤两次后，稀释到最终的OD600nm值在1以内。以蒸馏水为空白对照，测定其在波长600 nm处的吸光度值。

1.3.4 CO2排放量、还原糖、酒精度的测定

CO2排放量、还原糖和酒精度的测定分别采用称重法、斐林试剂法和酒精计比重法[14]。

1.3.5 乙酸乙酯的测定

发酵结束后蒸馏发酵液得到含有乙酸乙酯的待测样品，采用GC法检测乙酸乙酯的含量[15]。检测条件为：Agilent 1909N-213毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；检测器为火焰离子化检测仪（flame ionization detector，FID）；进样口的温度设置为200℃；检测器的温度为200℃；进样量为1 μL；分流比为5∶1；载气为高纯度氮气（N2），流速为2.0 mL/min。升温程序：起始柱温设置为50℃，保持8 min，再以5℃/min的升温速度上升至120℃，保持5 min。

1.3.6 乙酰辅酶A含量的测定

样品制备：取10mL发酵液以8000r/min、4℃离心10min，0.25 mol/L pH 5磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）1 mL洗两次，8 000 r/min、4℃离心10 min，去上清，用1 mL 6%高氯酸重悬，逐滴加入0.3 mol/L的碳酸钾溶液进行盐沉淀（添加的过程中漩涡振荡使其充分混匀），调节pH值为3.0，12 000 r/min、4 ℃离心10 min除去高氯酸钾（KClO4）晶体。

上清液转移到EP管中，用0.22 μm针头式过滤器过滤，然后进行乙酰辅酶A含量的高效液相色谱法分析，其检测条件[16]为：ZORBAX Eclipse PlusC18色谱柱（250m×4.6 mm×5 μm）；流动相为0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液（A）90%和乙腈（B）10%；流速1 mL/min；柱温25℃；紫外检测波长254 nm；进样量10 μL。

1.3.7 乙酰辅酶A合成酶酶活的测定

乙酰辅酶A合成酶活力的测定参考KUANG Y等[17]的方法，反应混合液（1 mL）包含100 μmol Tris-HCl缓冲液（pH8.0），5μmol1-萘乙酰胺（1-naphthaleneacetamide，NAD）+，0.1 μmol CoA，5 μmol苹果酸，150 U苹果酸脱氢酶，2.75 U柠檬酸合酶，10 μmol乙酸钾，10 μmol三磷酸腺苷ATP以及适量的粗酶液，30℃反应（反应时间20 min），测定在波长340 nm处吸光度值的变化。

乙酰辅酶A酶合成酶活力定义：每分钟催化底物生成1 μmol的NADH为1个酶活力单位（U）。

1.3.8 重组菌株的表达

从YEPD斜面上挑取1环突变菌种分别接入含5 mL一级种子培养基的试管中，30℃静置培养24 h，进入稳定期后，按照10%的接种量将其接种到含45 mL二级种子培养基中，30℃静置培养16～17 h，按照10%接种量接种到发酵培养基，不添加前体乙醇和乙酸，30℃静置发酵96 h，每隔12 h称质量1次，发酵结束后测定CO2排放量、酒精度、发酵液残余还原糖、乙酸乙酯的含量、乙酰辅酶A含量及乙酰辅酶A合成酶酶活，每个样品做3个平行，取平均值。

2 结果与分析

2.1 ACH1基因缺失对乙酸乙酯生成量和乙酰辅酶A含量的影响

出发菌株α5和突变株α5ΔACH1用发酵培养基进行发酵，不添加酒精和乙酸，发酵96 h后，测定发酵液中乙酸乙酯生成量和乙酰辅酶A含量，结果如图3所示。由图3可知，突变株α5ΔACH1乙酸乙酯生成量为11.90 mg/L，比出发菌株α5增加了10.59%；突变株α5ΔACH1的乙酰辅酶A含量比出发菌株α5增加了52.5%。结果表明，ACH1基因缺失可以减少乙酰辅酶A的分解，从而提高乙酸乙酯的产量。

图3 突变株α5ΔACH1和出发菌株α5乙酸乙酯生成量和乙酰辅酶A含量Fig.3 Production of ethyl acetate production and acetyl-CoA contents of mutant strain α5ΔACH1 and original strain α5

2.2 过表达ACS1和ACS2基因对乙酸乙酯生成量和乙酰辅酶A含量的影响

（1）生长曲线的测定

测定出发菌株α5和重组菌株α5ΔACH1、α5-A1、α5-A2的生长曲线，结果如图4所示。由图4可知，重组菌株α5-A1与出发菌株α5的生长速率基本一致。菌株α5-A2表现出最高的生长速度和生物量，最大生物量为OD600nm值为17.60，菌株α5ΔACH1的最终生物量低于出发菌株，说明ACH1基因敲除影响酵母菌株的正常生长。

图4 菌株α5ΔACH1、α5-A1、α5-A2和α5的生长曲线Fig.4 Growth curves of strain α5ΔACH1,α5-A1,α5-A2 and α5

（2）乙酸乙酯及乙酰辅酶A含量的测定

将出发菌株α5和重组菌株α5-A1和α5-A2用发酵培养基进行发酵，发酵96 h后，测定菌株乙酸乙酯的生成量和乙酰辅酶A含量，并用双尾t检验进行统计学分析，结果如图5所示。由图5可知，重组菌株α5-A1和α5-A2的乙酸乙酯产量分别为13.57mg/L和13.31mg/L，分别比突变菌株α5ΔACH1提高14.03%和11.85%，比出发菌株α5增加26.12%和23.70%。结果表明，过表达ACS1基因和ACS2基因可以提高酵母细胞中乙酸乙酯的合成，且ACS1基因比ACS2基因的过表达更有利于乙酸乙酯含量的提高。

图5 菌株α5、α5ΔACH1、α5-A1和α5-A2乙酸乙酯生成量和乙酰辅酶A含量Fig.5 Production of ethyl acetate production and acetyl-CoA contents of strain α5,α5ΔACH1,α5-A1 and α5-A2

突变株α5-A1和α5-A2乙酰辅酶A含量比突变株α5ΔACH1分别提高了80.33%和52.79%，比出发菌株α5分别提高了175.00%和133.25%。结果表明，工程菌株过表达ACS1基因和ACS2基因可以提高酵母细胞中乙酰辅酶A含量。

（3）基因表达水平及乙酰辅酶A合成酶酶活力测定

为了分析重组菌株中ACS1和ACS2基因的转录水平，分别测定了出发菌株α5和重组菌株α5-A1和α5-A2的基因转录水平差异，结果如图6所示。由图6可知，在重组菌株α5-A1中，ACS1基因的表达水平是出发菌株α5的3.3倍，在重组菌株α5-A2中，ACS2基因的表达水平是出发菌株α5的1.9倍。结果表明，过表达ACS1和ACS2基因均提高了其转录水平。

在转录水平提高的基础上，进一步测定了菌株α5和重组菌α5-A1和α5-A2的乙酰辅酶A合成酶的酶活力，结果如图6所示。由图6可知，重组菌株α5-A1和α5-A2的乙酰辅酶A合成酶酶活分别比出发菌株α5提高了1.5倍和1.2倍。结果表明，过表达ACS1和ACS2基因后，乙酰辅酶A合成酶酶活均提高，且过表达ACS1比过表达ACS2基因的酶活高。

图6 菌株α5、α5ΔACH1、α5-A1和α5-A2基因表达水平和乙酰辅酶A合成酶酶活Fig.6 Gene expression levels and acetyl-CoA synthesis activity of strain α5,α5ΔACH1,α5-A1 and α5-A2

2.3 过表达ATF1基因对乙酸乙酯生成量的影响

（1）CO2排放量、还原糖和酒精度的测定

将过表达ATF1基因的 菌 株α5-ATF1、ΔA-ATF1、A1-ATF1及A2-ATF1，以及亲本菌株α5在发酵培养基中发酵，发酵96 h后测定CO2排放量、还原糖和酒精度，结果见表2。由表2可知，在相同发酵条件下，与出发菌株α5相比，除α5-ATF1的CO2排放量外，其他重组菌的CO2排放量、还原糖和酒精度基本无太大的变化，结果表明，过表达ATF1基因对菌株的发酵性能基本没有明显的影响。

表2 出发菌株和重组菌株发酵性能的比较Table 2 Comparison of the fermentation performance of the original strain and recombination strains

（2）乙酸乙酯生成量的测定

出发菌株与重组菌株乙酸乙酯的生成量测定结果如图7所示。由图7可知，单独过表达ATF1基因α5-ATF1菌株产生的乙酸乙酯为对照菌株α5的315.09%，重组菌A1-ATF1乙酸乙酯生成量最高，达到72.52 mg/L，是重组菌α5-ATF1的204.14%，重组菌A2-ATF1乙酸乙酯生成量为44.80 mg/L，是重组菌α5-ATF1的125.67%，重组菌重组菌ΔA-ATF1比α5-ATF1产乙酸乙酯显著增加。由此可以得出，在提高乙酰辅酶A的基础上，进一步增加醇乙酰基转移酶的活性，可显著提高乙酸乙酯生成量。

图7 过表达ATF1基因菌株乙酸乙酯生成量Fig.7 Ethyl acetate content of the strains with overexpression of ATF1gene

3 结论

乙酸乙酯是清香型白酒的主体香，一直备受关注。本研究通过基因工程手段提高酿酒酵母分泌乙酰辅酶A的能力，从而提高乙酸乙酯生成量。通过ACH1基因缺失的α5ΔACH1菌株表达发现，乙酰辅酶A含量较亲本菌株α5稍有提高，但对提高乙酸乙酯生成量的效果并不明显，分析原因可能是ACH1基因定位于线粒体中，其增加的是线粒体中乙酰辅酶A的含量，线粒体中的乙酰辅酶A无法流向乙酸乙酯的合成。在ACH1基因缺失的基础上，过表达ACS1和ACS2基因得到工程菌株α5-A1和α5-A2，乙酸乙酯生成量分别比亲本菌株α5提高26.12%和23.70%；乙酰辅酶A含量分别比α5ΔACH1提高了80.33%和52.79%；结果表明，过表达ACS1和ACS2基因均能提高乙酰辅酶A含量和乙酸乙酯生成量，且乙酸乙酯生成量和胞内乙酰辅酶A的增加量呈正相关。在过表达ACS1和ACS2基因的基础上，过表达醇乙酰基转移酶ATF1基因得到工程菌株A1-ATF1和A2-ATF1，乙酸乙酯含量分别为72.52mg/L和44.80mg/L，分别是单独过表达ATF1基因a5-ATF1的204.14%和125.67%，且ΔA-ATF1比α5-ATF1产乙酸乙酯显著增加，结果表明，在底物乙酰辅酶A充足的条件下，提高醇乙酰基转移酶活性，能够提高乙酸乙酯的生成量。本研究为后续研究酿酒酵母乙酸乙酯的合成奠定了基础。

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