新疆芜菁总黄酮大孔吸附树脂纯化工艺研究

王　菁，古娜娜·对山别克，海力茜·陶尔大洪

(1新疆维吾尔自治区第六人民医院药剂科;新疆医科大学2附属肿瘤医院药学部;3药学院，乌鲁木齐　830011)

·药学研究·

新疆芜菁总黄酮大孔吸附树脂纯化工艺研究

王菁1，古娜娜·对山别克2，海力茜·陶尔大洪3

(1新疆维吾尔自治区第六人民医院药剂科;新疆医科大学2附属肿瘤医院药学部;3药学院，乌鲁木齐830011)

摘要：目的研究大孔吸药剂科附树脂纯化新疆芜菁总黄酮的工艺条件。方法以比吸附量、吸附率、解吸率为指标，采用静态吸附对5种大孔吸附树脂进行筛选；采用UV法以上样液浓度、吸附流速、树脂柱径高比、泄露曲线、洗脱剂浓度、吸附次数、洗脱曲线等参数为指标对纯化工艺进行筛选。结果用HPD-100大孔树脂纯化新疆芜菁总黄酮的最佳工艺为：层析柱径高比1∶10，上样速率2mL/min，上样质量浓度0.24mg/mL，重复吸附1次，洗脱剂95%乙醇，洗脱剂用量1BV。结论HPD-100树脂适合于新疆芜菁总黄酮的分离与纯化。

关键词：新疆芜菁；总黄酮；大孔吸附树脂；纯化

中图分类号：R943

文献标识码：A

西双说的确是这样。什么叫夫妻？患难与共才叫夫妻，对不对？现在我借给她们三万块钱，这三万块钱，她们必须得还。假如我们复了婚，这三万块钱，就变成共同财产，拥有者变成我和她，当然就不必还了。你听说过哪位妻子还他丈夫的钱吗？更何况还是给她治病的钱。

文章编号：1009-5551(2018)05-0606-04

排除标准：①有颈椎病手术史；②由脊髓肿瘤、外伤或其他疾病引起的颈椎病；③固定节段不在此范围或联合其他手术的患者。

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.019

基金项目：国家自然科学基金(81460615)

作者简介：王菁(1986-)，女，硕士，药师，研究方向：天然药物分析。

通信作者：海力茜·陶尔大洪，女，硕士，教授，博士生导师，研究方向：天然药物的开发和研究，E-maiL:haiLiqian2471@sina.com。

本文引用：王菁，古娜娜·对山别克，海力茜·陶尔大洪.新疆芜菁总黄酮大孔吸附树脂纯化工艺研究[J].新疆医科大学学报，2018,41(5):606-609.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.019

PurificationoftotalflavonoidsoftheXinjiangBrassicarapaL.bymacroporousresin

WANGJing1，GunanaDuishanbieke2，HailiqianTaoerdahong3

(1DepartmentofPharmacy,theSixthPeople′sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,2DepartmentofPharmacy,theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,3SchoolofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo study the purification technology of total flavonaoids of XinjiangBrassicarapaL.Methods5 different macroporous resins were compared by static absorption method with adsorption capacity,adsorption rate,desorption rate as indexes.Using the concentration of sample solution,flow velocity,ratio of diameter to height,adsorption-leakage curve,concentration of eluent,times of adsorption,elution curve as indexes,the purification technology was optimized by UV.ResultsThe optimal purification technology of HPD-100 macroporous resin was as follows:the rate of diameter to height is 1:10,sampling flow rate as 2mL/min,the concentration of the sample solution flow rate was 0.24mg/mL,repeated adsorbing again,eluting with 95% ethanol,elute volume was 1BV.ConclusionThe HPD-100 macroporous resin can be applied to separate and purify of total flavonoids of the XinjiangBrassicarapaL.

Keywords:XinjiangBrassicarapaL.;total flavonoids;macroporous resin;purification

新疆芜菁(XinjiangBrassicarapaL.)为十字花科植物芸苔属芸苔种芜菁亚种2年生草本植物的块根[1]，其花为芜菁花，种子为芜菁子。新疆芜菁根茎扁圆，味道与国内其他产地有所不同，是一个地方品种,主要含有黄酮、多糖、硫代葡萄糖苷等化学成分[2-3]。《维吾尔药志》记新疆芜菁性温，具有开胸顺气、健胃消食、利湿解毒、平喘止咳等功效，用于胸闷腹胃胀痛、食欲不振、疮疖肿毒等疾病的治疗[4]。近代药理研究表明，新疆芜菁还具有抗诱变[5]、抗衰老[6]、抗辐射、延长果蝇的寿命[7]、抑制肝癌细胞生长[8]等作用。本研究采用紫外分光光度法，通过单因素实验和正交实验对新疆芜菁总黄酮的最佳提取工艺进行了筛选，对新疆芜菁总黄酮进行了纯化研究，现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器UV-1102型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)，KQ-300VDE型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，FW-200型万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)，AB135-S型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2试药芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所，批号0080-9705)，D101型、HPD-100型、HPD-300型、HPD-400型树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，AB-8型树脂(天津市光复精细化工研究所)，氢氧化钠(天津市富宇精细化工有限公司，批号20170312)，亚硝酸钠(天津市富宇精细化工有限公司，批号20161210)，氢氧化铝(天津市富宇精细化工有限公司，批号20170212)，95%乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20170428)，均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3药材芜菁药材2016年9月购自新疆艾力努尔农业开发有限公司，经新疆医科大学药学院生药学教研室帕丽达教授鉴定为十字花科植物芸苔属芸苔种芜菁亚种二年生草本植物新疆芜菁(Xinjiang Brassica rapa L.)的块根。

2　方法与结果

2.1树脂预处理将5种型号(HPD-100、HPD-300、HPD-400、D101和AB-8)的大孔树脂，用95%的乙醇溶液浸泡24h，使其充分的溶胀，湿法装柱，用蒸馏水-乙醇(1∶5)冲洗至流出液不呈白色浑浊为止，再用蒸馏水洗至无醇味，自然晾干，备用。

2.2新疆芜菁总黄酮的制备称取新疆芜菁5 g，加75%乙醇溶液300mL回流提取2.5 h，滤过，减压浓缩，然后用蒸馏水定容至25mL，备用。

2.3标准曲线的绘制吸取对照品溶液1、2、3、4、5、6mL分别置于25mL容量瓶中，各依次加入5%亚硝酸钠溶液1mL，振摇后放置5min，加入 10%硝酸铝溶液1mL，振摇后放置6min，加4%氢氧化钠溶液10mL，用60%乙醇定容至刻度，以60%乙醇作为空白对照，测定510 nm处的吸光度，以芦丁溶液浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得到标准溶液浓度与吸光度之间的回归方程Y=13.364X-0.008 6(r=0.9993)，表明线性关系良好。

2.4静态吸附-解吸性能考察试验将预处理的5种型号大孔树脂D101、AB-8、HPD-100、HPD-300和HPD-400各称取1g分别置于50mL具塞三角瓶中，加入样品溶液25mL(总黄酮浓度为2.0341mg/g)，放入振荡器振摇6h，静置24h后，过滤。用蒸馏水定容至25mL容量瓶，再从中吸取5mL用蒸馏水至25mL容量瓶，按“2.3”项下方法测定吸光度，按公式：比吸附量=(初始质量浓度-剩余质量浓度)×溶液体积/干树脂质量，计算总黄酮比吸附量。将充分吸附的5种型号大孔树脂分别置于50mL具塞三角瓶中，加入75%乙醇25mL进行解析，在振荡器振摇6h，静置24h后，过滤，用蒸馏水定容至25mL容量瓶，再从中吸取10mL定容至25mL容量瓶，按“2.3”项下方法测定吸光度，按公式：比解吸量=(解吸液质量浓度×解洗液体积)/干树脂质量，解吸率=比解吸量/比吸附量×100%，计算总黄酮比解吸量和解吸率。结果5种树脂中HPD-100的吸附量最高并且解吸率也为最高，故采用HPD-100型树脂纯化富集新疆芜菁总黄酮，见表1。

表1　不同大孔吸附树脂静态吸附与解吸结果

2.5动态吸附实验

2.5.1径高比对HPD-100型树脂吸附量的影响称取预处理好的HPD-100的大孔树脂10、20、30g，分别湿法上柱装于同一型号(2.1cm×11cm)的柱子中，径高比分别为1∶5、1∶10、1∶15，分别加入“2.2”项下制备的新疆芜菁总黄酮提取液(1.79mg/g)25mL，吸附2次，静置1 h，用2BV(柱体积)蒸馏水以2mL/min的流速通过层析柱洗脱杂质，收集流出液定容至250mL容量瓶，吸取流出液5mL，按“2.3”项下方法测定流出液中总黄酮含量，计算树脂比吸附量。再用75%乙醇冲洗柱子，至洗脱液无色透明，将洗脱液置于250mL容量瓶，定容后精密吸取10mL，按“2.3”项下方法测定其中黄酮的含量，计算解吸率，结果当径高比1∶10时，总黄酮的比吸附量、比解吸量和解吸率最好，见表2。

表2　径高比对HPD-100型树脂吸附量的影响(n=3)

2.5.2上样液浓度对HPD-100树脂纯化新疆芜菁总黄酮的影响取3份预处理好的HPD-100的大孔树脂，径高比1∶10，分别湿法上柱装于同一型号(2.1cm×11cm)的柱子中，取上样原液3份各25mL(总黄酮浓度为2.4mg/g)，分别加入蒸馏水0、25、50mL，吸附2次，静置1 h，用2 BV蒸馏水以2mL/min的流速通过层析柱洗脱杂质，收集流出液，定容至250mL容量瓶，吸取5mL，按“2.3”项下测定流出液中总黄酮量，计算树脂比吸附量。再用75%乙醇冲洗柱子，至洗脱液无色透明，将洗脱液置于250mL容量瓶，定容后精密吸取10mL，按“2.3”项下方法测定黄酮的含量，计算解吸率。当上样溶液中黄酮浓度为0.48mg/mL时，比吸附量较大，但浓度太高，使其在解吸时不能完全解吸下来；当黄酮浓度为0.12mg/mL时，比吸附量，比解吸量和解吸率与黄酮浓度为0.24mg/mL相差不大，故选择黄酮浓度为0.24mg/mL，见表3。

表3　上样液总黄酮浓度对HPD-100树脂纯化新疆芜菁总黄酮的影响(n=3)

2.5.3吸附次数对HPD-100树脂纯化新疆芜菁总黄酮的影响取3份预处理好的HPD-100的大孔树脂，径高比1∶10，分别湿法上柱装于同一型号(2.1cm×11cm)的柱子中，取上样原液3份各25mL(总黄酮浓度为2.38mg/g)，静置1 h，以不同吸附次数，吸附完全后，用2 BV蒸馏水以2mL/min的流速通过层析柱洗脱杂质，收集流出液，定容至250mL容量瓶，吸取5mL，按“2.3”项下方法测定流出液中总黄酮量，计算树脂比吸附量。再用75%乙醇冲洗柱子，至洗脱液无色透明，将洗脱液置于250mL容量瓶，定容后精密吸取10mL，按“2.3”项下方法测定其中黄酮的含量，计算解吸率。吸附2次时新疆芜菁总黄酮的比吸附量、比解吸量和解吸率较高，见表4。

2.5.4上样速率对HPD-100树脂纯化新疆芜菁总黄酮的影响取预处理好的3份HPD-100的大孔树脂，径高比1∶10，分别湿法上柱装于同一型号(2.1cm×11cm)的柱子中，取上样原液3份各25mL(总黄酮浓度为2.38mg/g)，静置1 h，吸附2次，静置1 h，用2 BV蒸馏水分别以1、2、3mL/min的流速通过3个层析柱洗脱杂质，收集流出液，定容至250mL容量瓶，吸取5mL，按“2.3”项下方法测定流出液中总黄酮量，计算树脂比吸附量。再用75%乙醇冲洗柱子，至洗脱液无色透明，将洗脱液置于250mL容量瓶，精密吸取10mL，按“2.3”项下方法测定黄酮的含量，计算解吸率。当上样速率为2mL/min时，新疆芜菁的总黄酮解吸率较高，见表5。

表4　吸附次数对HPD-100树脂纯化新疆芜菁总黄酮的影响(n=3)

表5　上样速率对HPD-100树脂纯化新疆芜菁总黄酮的影响(n=3)

2.5.5不同洗脱剂浓度对HPD-100树脂纯化新疆芜菁总黄酮的影响取预处理好的3份HPD-100的大孔树脂，径高比1∶10，分别湿法上柱装于同一型号(2.1cm×11cm)的柱子中，取上样原液4份25mL(总黄酮浓度为2.20mg/g)，静置1 h，吸附2次，静置1 h，用2 BV蒸馏水以2mL/min的流速通过层析柱洗脱杂质，收集流出液，定容至250mL容量瓶，精密吸取5mL，按“2.3”项下方法测定流出液中总黄酮量，计算树脂比吸附量。再分别用35%、55%、75%和95%乙醇进行冲洗柱子，收集流出液，定容至250mL容量瓶，吸取10mL，按“2.3”项下方法测定其中黄酮的含量。当乙醇浓度的不断升高，产物的比吸附量，比解吸量及解吸率也随之升高，故选用95%乙醇作为洗脱溶剂，见表6。

表6　不同洗脱剂浓度对HPD-100树脂纯化新疆芜菁总黄酮的影响(n=3)

2.5.6泄露曲线的绘制将质量浓度为2.20mg/g的样品液加入已处理好的HPD-100树脂柱(径高比1∶10)，以2mL/min的流速进行动态吸附，静置1 h，流出液每10mL收集一管，在510 nm处测定吸光度，计算总黄酮含量，以管数为横坐标(X)，总黄酮吸光度值为纵坐标(Y)，绘制树脂的泄露曲线。当上样体积达到60mL时，即上样总体积的30%时，黄酮已经出现明显的泄露，说明树脂柱不能完全的吸附药液中的总黄酮，为了使总黄酮保留完全，将最大的上样量30%定为上样量，见图1。

2.5.7洗脱液用量的选择吸取25mL “2.2”项下制备的新疆芜菁总黄酮提取液(2.19mg/g)加入已处理好的HPD-100树脂柱(径高比1∶10)，静置1 h，吸附2次，吸附完全后，用2 BV蒸馏水以2mL/min的流速通过层析柱洗脱杂质，再用95%的乙醇洗脱，每10mL为1个流分，测定各流份中总黄酮含量，直至洗脱液基本无色时停止，结果在洗脱至90mL(1 BV)洗脱剂时，总黄酮可基本完全洗脱，故选择95%乙醇1 BV。

2.6纯化工艺验证称取样品50 g，加75%乙醇溶液3000mL回流提取2.5 h，减压浓缩并定容至500mL容量瓶。量取样品溶液120mL(初始黄酮浓度2.20mg/g)，按上述确定的工艺上柱，树脂100 g(径高比1∶10)，静置1 h，吸附2次，2 BV蒸馏水(900mL)以2mL/min的流速进行洗脱，弃去蒸馏水，再用1 BV(450mL)95%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，按“2.3”项下方法操作测定总黄酮含量。纯化后总黄酮含量提高了约10倍，说明HPD-100树脂对新疆芜菁总黄酮具有良好的纯化作用，见表7。

表7　纯化工艺验证实验结果(n=3)

3　讨论

新疆芜菁在新疆的南部种植广泛，当地维吾尔族等少数民族称之为恰玛古儿[9-12]。大孔吸附树脂技术具有成本较低、选择性好、再生处理简单、吸附速度快等优势，已广泛应于天然药物中有效成分的分离纯化[13-14]。本研究通过静态吸附-解吸性能考察对多种型号的大孔吸附树脂进行比较，最终选用HPD-100型大孔吸附树脂，并对其纯化新疆芜菁总黄酮的工艺条件进行考察研究。最佳提取工艺为：层析柱径高比1∶10，上样速率2mL/min，上样质量浓度0.24mg/mL，重复吸附1次，洗脱剂95%乙醇，洗脱剂用量1 BV。纯化工艺验证结果示，本工艺纯化后总黄酮含量较样品液中总黄酮初始含量提高了约10倍。该方法操作简单、工艺稳定，为新疆芜菁总黄酮成分的进一步精制及其药用价值的开发提供理论依据和实践基础。

[收稿日期：2017-07-06]

(本文编辑施洋)