鸭瘟病毒感染的诊断与病毒分离鉴定

李小伦

鸭瘟（ Duck plague，DP）俗称“大头瘟”，又名鸭病毒性肠炎（ Duck viral enteritis， DVE），是由鸭瘟病毒（ Duck plague virus，DPV）引起的一種急性、败血性及高度致死性的传染病。本病的特征是体温升高，病鸭肿头流泪，下痢，食道黏膜出血或坏死，两腿麻痹，排出绿色稀粪，剖检特征可见心脏表面有针尖大小的出血点，肝脏肿大明显，呈土黄色，质脆，肝脏表面有针尖大灰色坏死灶和出血点，胆囊肿大，脾肿大，肺充血、出血和坏死，咽喉部有黏液、气管内有少量浆液性分泌物。本病流行广泛，该病一旦发生，传播迅速，发病率和死亡率高，能够造成非常大的经济损失，是危害养鸭业的最主要疫病之一。加强鸭瘟病毒诊断对预防和控制本病都具有重要的现实意义，本文通过对养殖场发生的一例鸭瘟病毒感染的诊治，以期为广大养殖户提供参考，现将整个诊治过程介绍如下。

1材料和方法

1.1主要试剂与试剂盒

pMD18-T克隆载体购自宝生物（大连）有限公司；病毒基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物科技有限公司。

1.2临床诊断

1.2.1临床症状 观察发病鸭的临床症状。

1.2.2病理变化对病死鸭解剖，观察病理变化。

1.3实验室PCR检测

1.3.1病料样品的处理无菌采集病鸭的病变组织，研磨后反复冻融3次，离心取上清液即得处理后的病料样品。1.3.2引物设计与合成根据参考文献合成1对鸭瘟特异性检测引物（上游引物P1：5-CGACTACA TCCA TACC CACT-3；下游引物P2：5- TATGCTTC AGCT ACAC TA-3，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 PCR扩增取处理后的病料样品0.2mL，利用病毒基因组提取试剂盒提取DNA后进行PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s， 47℃30s， 72℃45s，35个循环；72℃10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4病毒分离与鉴定

1.4.1病毒的增殖取处理后的病料样品2.OmL经0.45 ym滤器过滤除菌后，绒毛尿囊膜途径接种10日龄鸭胚10枚，120h后收集含痘斑的鸭胚尿囊膜和鸭胚尿囊液，经鸭胚尿囊膜剪碎并用尿囊液制成悬液，12000r/min离心15min，取上清液，-20℃保存。

1.4.2分离毒株PCR鉴定取保存的病毒液0.2mL，按照1.3.3的方法进行PCR扩增与检测。

1.4.3核酸序列测定PCR扩增产物经胶回收试剂盒回收纯化，连接至pMD18-T克隆载体，质粒提取试剂盒提取重组质粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2结果与分析

2.1发病鸭临床症状

病鸭初期表现精神沉郁，食欲不振，之后排黄绿色稀便，眼睑水肿，头部肿大，双翅下垂，两腿麻痹，不愿走动，发病3～5d死亡。

2.2发病鸭病理剖检

剖检可见鸭肝表面以及切面有大小不等的灰白色坏死点及小出血点，喉头及气管黏膜充血，咽喉部及气管有黏液性分泌物，腺胃、肌胃、脾脏和肾脏呈出血性坏死，肺脏出血水肿，头颈部皮下组织胶样浸润。2.3病料PCR检测

PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在位于510bp处可见特异性DNA扩增条带，与预期大小相符。

2.4病毒增殖

鸭胚接种后96—120h死亡，鸭胚全身有点状出血和水肿，鸭胚尿囊膜增厚，出现白色痘斑。

2.5孩酸序列测定

测序结果经过Blast序列比对，表明插入到pMD18-T载体的基因片段的核苷酸序列为鸭瘟病毒的特异性序列，通过分子生物学手段进一步证明该鸭场发生了鸭瘟病毒感染，为发病鸭场的疾病防控提供有力的技术保障。

3讨论

鸭瘟是一种传染性强、死亡率高的疾病，潜伏期一般为3～7d，感染鸭表现出精神不振，头颈部会成缩起的状态，病鸭喜欢独处，并比较喜欢饮水，发病初期会表现厌食和消瘦，眼睑肿胀，在出现症状后的3～ 5d内就会死亡，鸭瘟的早期症状有利于及时的发现并采取防控措施。本文通过对发病鸭场疑似鸭瘟症状的病鸭进行临床和实验室诊断，最终通过PCR检测、病毒分离和测序鉴定确定该鸭场发生了鸭瘟疫情，为发病鸭场找到了致病原，对有效控制该病的发生及传播具有重要意义。鸭场发生鸭瘟病毒感染后，要加强鸭群的日常饲养管理，加强免疫抑制病的防控，防止鸭瘟与其它细菌病和病毒病的继发感染，加强饲料的营养，提高鸭群的整体免疫力，注意鸭舍内的通风，减少各类不良应激的发生，为防控鸭瘟的发生大有裨益。鸭瘟病毒感染一般呈零星发病，规模养殖场做好鸭瘟的免疫接种一般不会发生大规模的暴发和流行，由于鸭瘟活疫苗的免疫周期短，免疫效果不够持久，所以建议规模化鸭场可以根据鸭体内的抗体监测水平进行免疫，鸭瘟高发地区可以联合应用活苗和灭活疫苗。根据鸭瘟的传染特点，发病初期要切断传染源，一旦发生鸭瘟疫情要及早隔离发病鸭，防止鸭瘟病毒扩散传播，注射相应的血清，这是最好的对症疗法。同时可选择用抗生素、抗病毒类药物和清热解毒类中药剂等进行辅助治疗，可有效降低感染后的死亡率。

参考文献：

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