红心杉组培苗增殖培养基的优化

韩吉思，方小荣，申礼凤，李建波，姚 茜，杨 梅

（1.广西大学林学院，广西 南宁 530004；2.广西国有高峰林场，广西 南宁 530002）

近年来，杉木组织培养技术在工厂化育苗中已经得到一定范围内的应用，但杉木人工造林仍以种子繁殖的实生苗为主，无性系幼苗在造林中的应用还较少，且杉木种子生产常受到气候及大小年等因素的影响，导致优良种子的产量波动较大［1］，严重制约着杉木人工林的可持续经营。而利用无性繁殖技术可以在短时间内获得大量遗传基因型一致的优良苗木，既可以弥补杉木传统育种的缺陷，又可以充分发掘优良遗传材料的遗传潜能，有利于商业化生产。很多科研人员在杉木组培方面做了大量探索，尤其在杉木愈伤组织培养、继代培养、组培苗诱导生根等方面取得了长足进步［2-3］。韦如萍等［4］研究了植物生长激素对杉木组培苗增殖和生根的影响，结果表明以MS+NAA 0.05 mg/L + 6-BA 0.3 mg/L +琼脂7 g/L +蔗糖30 g/L较适宜增殖培养，1/2MS + IBA 0.7 mg/L +琼脂7 g/L +蔗糖25 g/L适宜生根培养。李峰卿等［5］对杉木组培体系进行优化，其增殖倍数达到4.19，同时发现去除顶芽的外植体较之带顶芽的外植体在接种后增殖倍数有所提高。黄娟［6］研究指出，不同杉木外植体的表面灭菌效果存在明显差异，0.1% HgCl2处理10 min有利于下胚轴、子叶、未成熟胚和茎段4种外植体的灭菌。徐圆圆［7］、周锦业［8］研究了复配LED光质对杉木组培苗的影响，指出不同光质和光周期会产生不同效应。

红心杉〔Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.〕是杉木的特殊变异类型，属杉科杉属植物，喜生于气候温暖、降雨量多、湿度大、光照时间短的阴凉山区，具有抗逆性高、适应性强、生长快、树干圆直、纹理细密、坚韧耐腐等特征，且红心比率高、色泽独特、芳香，广泛分布于我国亚热带地区［9-10］。已有学者在红心杉组培方面进行了研究，如江香梅等［11］以红心杉优良无性系基部萌条为外植体建立了组培高效繁育体系。陈振科等［12］以红心杉优良单株组培苗为材料，研究了不同植物生长调节剂对组培苗生长和内源激素含量的影响。本试验将基本培养基、细胞分裂素苯基噻二唑基脲（TDZ）浓度及天然复合物香蕉汁浓度进行搭配组合，筛选最优的红心杉组培苗增殖培养条件，以期为进一步优化红心杉组培技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红心杉组培外植体材料取自广西贺州市八步区16年生红心杉林分的优树，以在广西大学组培室继代培养的第12代生长一致的组培继代瓶苗为试验材料。

1.2 试验方法

采用正交试验设计，选用基本培养基、TDZ浓度、香蕉汁浓度3个因素。其中，基本培养基设MS、3/4MS和1/2MS 3个处理，TDZ浓度设0、0.2、0.4 mg/L 3个水平，香蕉汁浓度设0、100、200 g/L 3个水平（表1）。各因素随机排列，进行正交试验。香蕉汁制备方法是按不同试验设计分别称取所需的香蕉量（质量体积比，W/V），捣烂后放入烧杯中，加入500 mL蒸馏水，置于电炉上加热至沸腾，然后用微火保持微沸20～30 min，过滤，去渣取汁作配制培养基用［13］。

表1 L9（34）正交试验设计因素水平

根据表1配制9个处理的培养基，分装至培养瓶，每瓶40 mL，贴好标签，连同用报纸包裹好的镊子、解剖刀、不锈钢盘、蒸馏水等置于高压蒸汽灭菌锅，121℃下灭菌，接种环境以紫外灯灭菌30 min，酒精擦拭超净工作台。在超净工作台上，将无菌发芽的健壮组培苗切除愈伤组织后切成约1.5 cm的茎段，接种于培养基上，每瓶6个茎段，每个处理3次重复，每个重复接种15瓶。将接种好的材料置于光照培养室中，培养温度24（±3）℃、光周期12 h/d、光照强度1 500 lx，30 d后统计组培苗的叶芽数并计算其增殖系数，准确称取杉木组培苗叶片并剪碎，测定叶绿素和可溶性糖含量。其中，增殖系数=总芽数/接种时芽数，叶绿素含量采用丙酮乙醇提取法［14］测定，可溶性糖含量采用蒽酮浓硫酸法［15］测定。

1.3 数据统计分析

所有数据采用Excel 2007软件处理并进行极差分析，采用SPSS软件［16］对数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较。由于各指标在不同处理间的表现存在差异，单一指标难以全面客观地反映不同植物生长调节剂的育苗效果［17］，因此，本试验采用多维空间（欧几米德）En综合评定法对各处理培养基进行综合评价［18］，以避免指标间相关性的影响和覆盖。具体方法如下：将所需评定的3个指标按9个处理列出原始数据表；在每一指标中选出最大值作标准值，并令其等于1，再将这一指标其他数值除以该指标中的最大值，所得的商填入矩阵坐标表；通过以下公式计算矩阵坐标表中各列数值与其他标准值商的离差平方和：

2 结果与分析

2.1 不同培养基对红心杉组培苗增殖系数的影响

从表2可以看出，在2号培养基（A1B2C2）中，红心杉组培苗的增殖系数最高、达2.72，显著高于其他处理，增殖系数最低的是8号培养基（A3B2C1）、仅1.72，前者是后者的1.6倍。各因素对增殖系数影响的大小表现为基本培养基＞香蕉汁浓度＞TDZ浓度，红心杉组培苗的增殖系数随着基本培养基浓度的增加呈上升趋势，适量浓度的TDZ和香蕉汁对增殖培养都有一定的促进作用，但是浓度过大时反而有抑制作用。

表2 不同培养基对红心杉组培苗增殖系数的影响

2.2 不同培养基对红心杉组培苗叶绿素含量的影响

由表3可知，红心杉组培苗在7号培养基（A3B1C3）中叶绿素含量最高（2.53 mg/g），显著高于除4号外的其他培养基处理，是叶绿素含量最低的2号培养基（A1B2C2、1.71 mg/g）的1.5倍。影响红心杉组培苗叶绿素含量的3个因素依次为基本培养基＞TDZ浓度＞香蕉汁浓度。TDZ和香蕉汁浓度提高时叶绿素含量呈上升趋势。

2.3 不同培养基对红心杉组培苗可溶性糖含量的影响

红心杉组培苗可溶性糖含量最高的处理是1号培养基（A1B1C1）、为33.84 mg/g，与6号、7号、8号、9号培养基存在显著差异，最低的9号培养基（A3B3C2）的可溶性糖含量仅20.68 mg/g（表4）。对红心杉组培苗可溶性糖含量的影响大小表现为基本培养基＞TDZ浓度＞香蕉汁浓度。基本培养基和香蕉汁浓度增加时可溶性糖含量都呈上升趋势，TDZ浓度增加时可溶性糖含量呈下降趋势。

表3 不同培养基对红心杉组培苗叶绿素含量的影响

表4 不同培养基对红心杉组培苗可溶性糖含量的影响

2.4 不同培养基对红心杉组培苗增殖效果的坐标综合评定

从表5可以看出，在9个处理中，4号培养基的红心杉组培苗各个指标都处于较高水平、增殖效果最好，∑Pi2值为0.0108；5号培养基效果第二；2号培养基对组培苗增殖系数的作用最好；7号培养基对叶绿素含量的影响最佳；1号培养基对可溶性糖含量的影响最佳。综合评定认为，红心杉组培苗的最佳增殖培养条件为3/4MS+香蕉汁100 g/L。

3 结论与讨论

本试验结果表明，不同培养基组合下红心杉组培苗的增殖系数、叶绿素含量、可溶性糖含量相差较大。培养基在植物生长过程中起到不可替代的营养物质成分，也是影响次生代谢产物合成的关键因素之一［19］，植物组织培养成功与否，一方面取决于培养材料自身的性质，另一方面也取决于培养基的种类和成分，不同的植物材料对培养基的要求不同，因而必须根据植物材料和培养目的的不同选择合适培养基，并按照不同的培养阶段加入适当的添加物。

表5 不同培养基对红心杉组培苗增殖效果的坐标综合评定

MS培养基是组培技术应用最广泛的培养基质，具有较高的増殖效果［20］。莫雅芳等［21］以杉木优良树种基部茎段为材料，在1/2MS+IBA 0.3 mg/L+6-BA 0.4 mg/L中培养25 d后腋芽增殖倍数较高。杨家鸿［22］研究认为，MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L适宜红心杉诱导培养。吕杰等［23］在研究基因型及基本培养基对玉米成熟胚培养的影响时发现，MS培养基更适合多数基因型的玉米愈伤组织的诱导培养。秦献泉等［24］以荔枝和龙眼茎段为外植体培养发现，MS培养基更适合荔枝和龙眼茎段芽的诱导。姜殿强等［25］研究表明，对铁皮石斛茎段丛生芽的增殖培养而言，MS培养基优于1/2MS、B5和N6培养基。本研究也发现，基本培养基是影响红心杉组培苗增殖培养的最主要因素，而3/4MS+香蕉汁100 g/L培养基更适合红心杉组培增殖。

适宜浓度的激素既有利于愈伤组织不定芽的形成，又会促进不定芽的生长发育［26］。因此，组培苗继代增殖过程中，掌握激素的使用种类及浓度具有重要意义。韦如萍等［27］研究发现，MS+NAA 0.05 mg/L适宜杉木的增殖培养；黄碧华［28］对杉木组培苗研究时得出1/2MS+6-BA 0.8 mg/L最适宜杉木的增殖培养。本试验也发现，适宜浓度的TDZ对红心杉组培苗增殖具有促进作用。黄卓辉等［29］认为TDZ能有效影响与细胞分化有关的各种酶的活性，从而影响植株生长。康大力等［30］研究结果表明，TDZ在喜树愈伤组织培养中可替代植物激素并对细胞植物色素积累有明显影响。崔瑾等［31］认为，TDZ能有效诱导芋茎尖的萌动、生长，促进大量丛生芽增殖和组培苗根系发生，提高驯化成活率，这也证实了本研究中TDZ对叶绿素含量和增殖的影响。在组织培养中还经常使用到椰汁、香蕉汁、苹果汁、番茄汁、马铃著汁等天然有机添加物［32］，这些有机添加物汁液中含有氨基酸、激素、酶和一些化学成分不明的有机物，其营养丰富但不稳定，是复杂的营养混合物，主要作用是为植物生长提供一些生理活性物质，补充一些未知的微量成分［33］。有研究表明，一定浓度的香蕉泥有利于铁皮石斛组培原球茎的分化，提高分化率［34］，有效提高铁皮石斛茎段和组培苗丛生芽的増殖系数［35］；添加香蕉汁适宜带叶兜兰丛生芽的诱导和增殖培养［36］。在本研究中，虽然香蕉汁对红心杉组培苗各项指标的影响不是最主要的，但是随着香蕉汁浓度的增加，红心杉组培苗的叶绿素、可溶性糖含量都有所提高，这可能与香蕉汁富含有机成分，对植株鲜重、株高和茎粗等的生长起到促进作用有关［37］，而叶绿素含量高有益于组培苗的增殖和生长［38-39］。郎贤波［40］研究丰满红树莓组培快繁时指出，可溶性糖含量对组培苗增殖具有促进作用。由于香蕉汁中含有激素等成分，所以在与TDZ配合使用时应进一步优化红心杉及其他杉木品种组培不同阶段的使用浓度，并探讨其对组培苗后期生长质量的影响。

组培是一个复杂繁琐的过程，培养基成分是影响组培成功与否的关键因素，而外源添加物种类和浓度的选择将会大大提高植物组培在诱导、增殖、生根等过程的成功率。红心杉的组培技术已取得一些进展，但多数研究集中于培养基选择、激素浓度等方面，在天然复合物应用研究方面还较少，而复合物在经济性上占很大优势，今后可在复合物种类、浓度方面进一步优化，以提高增殖率及芽苗质量，并在后续工作中探讨提高组培苗生根率的方法，达到红心杉组培快繁的目的。

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