小麦HMW-GS分子检测中DNA提取方法的改良

张婷婷 ，王陆军 ，郝建平 ，，王艳梅 ，王创云 ，李培良 ，邓艳芳 ，周 琼 ，李志敏 ，庞 冰 ，董永军，裴成成，牛学谦

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西 太原 030031；3.山西省玉米工程技术研究中心，山西 太原 030031）

随着人们对高品质小麦需求的增长，品质育种受到了更多科学家的关注。有研究表明，高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）组成是影响小麦品质的重要因素[1-2]。当前检测HMW-GS的方法主要包括SDS-PAGE凝胶电泳和等位基因特异性扩增（AS-PCR）[3-4]，其中，AS-PCR 方法操作简便，结果准确，可以实时检测，是实现小麦HMW-GS分子育种的有效检测方法。而高质量、高通量的DNA提取是实现HMW-GS实时检测的前提。前人提取基因组DNA的方法主要包括传统CTAB法[5-8]、SDS法[9-10]、碱裂解法[11-12]、酶解法、磁珠法[13]、硅胶柱法[14]等，这些方法多以幼叶为提取材料，存在成本高、周期长、操作复杂或质量不稳定等问题。

本研究在传统CTAB法的基础上，针对小麦种子蛋白、淀粉含量高的特点，结合磁珠法，旨在寻求一种操作简便、成本低廉、产率和质量稳定的DNA提取方法，以满足日益增加的HMW-GS高通量分子检测的需求。

1 材料和方法

1.1 材料

供试10份小麦材料（Triticum aestivum L.）均由山西省农业科学院作物科学研究所提供，其品种名称与亚基组成如表1所示。

1.2 试剂

2%CTAB裂解液，氯仿∶异戊醇（24∶1），70%乙醇，异丙醇，TE（含RNaseA），磁珠悬浮液。

表1 10份小麦材料及其亚基组成

1.3 仪器

HH数显恒温水浴锅（常州市第一纺织设备有限公司）；Tissuelyser-96全自动样品快速研磨仪（上海拓赫机电科技有限公司）；5810R低温高速离心机（德国Eppendorf艾本德股份公司）；PCR仪（德国Eppendorf艾本德股份公司）；K5600超微量紫外可见分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司）；JY-SPCT君意东方水平型琼脂糖凝胶电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；Tanon 2500凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 传统CTAB法 参照魏琦超等[15]的方法。

1.4.2 小麦DNA提取新方法 取1粒小麦种子，加入700 μL CTAB提取液（65℃）；粉碎成匀浆状；将样品放入65℃水浴锅中，水浴30 min；加入等体积氯仿/异戊醇混合液（体积比24∶1），充分混匀3 min；4 ℃，14 000 r/min 离心 10 min，取上清；重复抽提一次；加入5 μL的磁珠悬浮提取液，混匀，静置5 min，弃上清；用70%乙醇洗涤磁珠1～2次，风干磁珠；加 50 μLTE（含 RNaseA），65 ℃水浴 5 min，-20℃保存。

1.4.3 DNA质量检测

1.4.3.1 紫外分光光度法检测 采用紫外分光光度计测定DNA原液的浓度及其A260/230，A260/280的值。

1.4.3.2 琼脂糖凝胶电泳 取4 μL的DNA原液与2 μL的6×Loadingbuffer混合均匀，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，电压100 V，电泳60 min。

1.4.4 HMW-GS分子检测 引物1AX2*[16]序列F：5′-ATGACTAAGCGGTTGGTTCTT-3′；R：5′-ACCTT GCTCCCCTTGTCTTT-3′。以新方法提取的DNA为模板，对亚基2*进行AS-PCR，扩增程序参照孙岩等[17]的方法，并进行了改进，采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2 结果与分析

2.1 DNA产率比较

紫外分光光度计检测结果显示，新方法提取的DNA比对照（传统CTAB法）平均产率降低，标准差减小（表2）。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，对照的电泳条带亮度比较高，差异较大（图1），新方法提取的DNA电泳条带相对亮度较低，但差异较小（图2）。2种检测结果均证实了新方法提取的DNA产率降低，但稳定性更好。

表2 分光光度计检测结果

2.2 DNA质量比较

从表2可以看出，对照和新方法提取的DNA的A260/280平均值均在1.8～2.0，但新方法标准差较小。从图1，2可以看出，对照的DNA胶孔较亮，有拖尾现象，且条带不整齐，而新方法提取的DNA电泳条带清晰一致，背景噪点较少。因此，采用新方法提取的DNA质量更高更稳定。

2.3 HMW-GS分子检测

选择10份小麦种质资源，采用新方法提取的基因组DNA为模板，对亚基2*进行等位基因特异性扩增（AS-PCR）。电泳检测结果（图3）显示，条带清晰，片段大小为1 319 bp，这与SDS-PAGE检测结果一致。因此，新方法提取的DNA可以用于小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）的分子检测。

3 讨论与结论

本研究对DNA提取过程进行了改进：样品在CTAB裂解液的保护下直接机械粉碎破坏细胞壁，省去了液氮研磨；在沉淀DNA时，放弃加入异丙醇沉淀20 min，而采用磁珠定向吸附DNA，直接以70%的酒精洗涤。通过上述改进，提高了DNA的质量和稳定性，简化了操作，缩短了提取周期，使高通量提取成为可能。

本研究在测量DNA的A260/280值时发现2种方法的平均值均在理想范围内，虽然存在差异但不显著，在琼脂糖凝胶电泳检测中二者结果差异显著，尤其传统CTAB法提取的DNA一致性差，而新方法提取的DNA纯度高、稳定性好。说明紫外分光光度计所测得数值相对误差较大，这一结果与前人研究结果一致[18]。因此，在检测DNA质量时，建议先采用紫外分光光度计进行检测，然后以琼脂糖凝胶电泳验证结果。

HMW-GS分子检测相对SSR[19]等分子标记，对DNA质量要求更高，本研究检测了HMW-GS中的2*亚基，结果清晰准确，证明新方法可以用于小麦HMW-GS 分子检测[20]。

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