饲用酸度调节剂中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸的同步测定

邓 虹，雷 燕

（成都大帝汉克生物科技有限公司，成都 611130）

饲用酸度调节剂亦称pH调节剂，是指能够酸化饲料的一类物质。可降低饲料在消化道中的pH，为动物提供最适消化道环境，已在国内外得到广泛应用。是继抗生素之后，与益生素、酶制剂、微生态制剂等并列的重要添加剂，是一种无残留、无抗药性、无毒害作用的环保型添加剂。能保证有益菌群合理生长，病原微生物受到有效抑制，从而达到提高动物生长性能和饲料利用率、增强机体抗病能力的效果[1-3]。目前酸度调节剂不仅应用在仔猪生产中，在家禽、反刍动物上也有积极的效果，市场也出现了各种类型的酸度调节剂。国内外报道的有机酸的检测方法主要有电位滴定法、毛细管电泳法、气相色谱法、液相色谱法等[4-10]。但对苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸的同时检测分析还未见报道，本试验建立了高效液相色谱同时测定酸度调节剂中的6种有机酸的方法。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

本测定方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682中规定的二级水。磷酸二氢钾：优级纯。磷酸：色谱纯。乙酸标准品：纯度＞98%，美国SU⁃PELCO公司。乳酸标准品：纯度＞98%，美国SU⁃PELCO公司。柠檬酸标准品：纯度＞99%，美国SUPELCO公司。富马酸标准品：纯度＞99%，美国SUPELCO公司。苹果酸酸标准品：纯度＞99%，美国SUPELCO公司。丙酸标准品：纯度＞98%，美国SUPELCO公司。

1.2 仪器和设备

实验室常用仪器设备。分析天平：感量0.000 1 g。水系滤膜：孔径0.45 μm。有机滤膜：孔径0.45 μm。高效液相色谱仪，配VWD检测器。超声波清洗器。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Sepax GP-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：0.02 mol·L-1磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调节pH=3.5），流速：1.0 mL·min-1，检测波长：214 nm，色谱柱温度：30±1℃，进样体积：10 μL。

1.3.2 混合标准工作液

分别称取0.200 0 g（精确至0.000 1 g）苹果酸，0.200 0 g乳酸，0.200 0 g乙酸，0.200 0 g柠檬酸，0.200 0 g丙酸于100 mL容量瓶中，加20～30 mL蒸馏水溶解，制得溶剂1。称取富马酸标准品0.100 0 g，于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解后超声30 min，使难溶于水的富马酸完全溶解，冷却后定容，摇匀，取10 mL于溶剂1中。将溶剂1的溶液定容至100 mL，摇匀，此标准储备、液中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸的浓度均为2.0 mg·mL-1，富马酸的浓度为0.1 mg·mL-1，4℃下储藏，保存期1个月。

1.4 数据处理

试样中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸含量X，以质量分数表示，计算公式见式1。

式（1）中，C—由标准曲线得出的试样中果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸的浓度（mg·mL-1）；V—试样溶液总体积（mL）；m—试样的质量（g）。

2 结果与分析

2.1 样品的前处理

准确称取0.3～1.0 g（精确至0.000 1 g）酸度调节剂样品于100 mL容量瓶，超声30min，冷却后定容，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，等待上机。从市场上抽取有标示含量的3个酸度调节剂样品，检测结果色谱图见图1，保留时间在2～11 min。

图1 标准品与样品的高效液相色谱图

2.2 绘制标准曲线

分别取混合标准工作液按照上述色谱条件进行色谱分析测定。以各有机酸的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，各线性回归方程所对应的曲线即为相应有机酸的标准曲线。所述6种有机酸对应的线性回归方程及相关系数r见表1，方程中Y即为相应有机酸对应的峰面积，X即为有机酸的质量浓度。精密量取溶液为0.01 mg·mL-1的每种有机酸溶液10 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，根据标准曲线计算各种有机酸的测得浓度，再计算6次测得浓度的标准偏差，3倍标准偏差即为该酸度调节剂的检测限。

2.3 方法的重复性

连续检测5次样品1，计算各有机酸测得含量的相对标准偏差（RSD），结果见表2。结果表明，有机酸进样精密度良好，RSD＜4%。

2.4 回收率实验

在某样品中分别加入不同量的有机酸原料，配成6个已知样，在相同的色谱操作条件下，定量分析，计算，测得各个有机酸的回收率见表3。

表1 6种有机酸的线性回归方程、相关系数、检出限

表2 样品1中有机酸含量的相对标准偏差%

表3 样品1中有机酸的加标回收实验

3 讨论

3.1 色谱条件

影响有机酸分离效果主要取决于色谱柱和流动相的选择，色谱柱选用Zorbax Eclipse XDB-C18，Agilent SB-C18和Sepax GP-C18进行分析，发现Sepax GP-C18能很好的分离6种有机酸，特别是乳酸和乙酸的分离；流动相选用pH 2.5的磷酸水溶液，pH 2.7的0.01 mol·L-1磷酸氢二铵溶液，盐酸-乙腈溶液,pH 3.5的0.02 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲溶液进行分析，发现磷酸二氢钾缓冲溶液能让分离效果更加优异，而且在11 min内即可完成检测，缩短了检测时间，提高了检测效率。

3.2 前处理的选择

苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸均易溶于水，前处理直接加入蒸馏水即可。富马酸微溶于水，需要超声或者加热水才能将其在短时间内完全溶解，且富马酸的峰响应值大，需要单独稀释后再加入混合标准液中。

3.3 实际应用

应用建立的方法，从市面上获得已知含量的酸度调节剂进行测定，检测结果见表4。

检测结果表明，本方法能满足对酸度调节剂中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸的测定需求。

表4 已知含量的酸度调节剂检测结果

4 饲用酸度调节剂应用前景

酸度调节剂中有机酸主要作为饲料的酸味剂被广泛使用，不仅可提高饲料的适口性，促进采食，而且具有防腐保健作用，并可预防饲料被霉菌污染；还具有微生物作用，可减少动物胃肠道中有害微生物的繁殖，同时可降低饲料pH，激活消化酶，有助于消化吸收营养物质，提高饲料转化率，为动物提供能量等功能[11]。由于这些酸被完全代谢，并安全无毒而被许多国家批准用于动物饲料的日粮成分，其发展前景广阔[12]。

[1] 赵先铭,曾清华,丁永忠.酸化剂的作用机理及其应用[J].中国饲料,2002（11）：22-23.

[2] 秦圣涛,张宏福,唐湘方,等.酸化剂主要生理功能和复合酸选配依据[J].动物营养学报,2007,19（1）：515-520.

[3] 林海丹,邓宇翔,王松波,等.饲用酸化剂的作用机制和应用现状[J].广东饲料,2009,18（5）：23-25.

[4] 索德成,李兰,樊霞.饲用酸化剂中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸的同步测定[J].饲料工业,2012,33（21）：60-62.

[5] 王洪丽,李成云.气相色谱法测定苜蓿青贮料中的有机酸[J].饲料工业,2008,29（16）：58-60.

[6] 任清.衍生化-毛细管气相色谱法同时测定饲料添加剂中富马酸、乳酸和柠檬酸[J].分析化学,2002,30（3）：304-306.

[7] 庞新安,万英.反相高效液相谱法测定果品中有机酸[J].中国食物与营养,2007（11）：40-41.

[8] 毕丽君,张骊,张鸿发.固相萃取高效液相色谱法分析酱油中的有机酸[J].分析化学,2000,28（11）：1 391-1 394.

[9] 谢明,吴莹莹,侯水生.饲料有机酸化剂中乙酸、柠檬酸的高效液相色谱检测分析[J].饲料工业,2004,25（10）：48-49.

[10] 吴剑平,商军.高效液相色谱法同时测定复合有机酸化剂中5种成分的含量[J].中国饲料,2008（14）：36-39.

[11] 刘瑞,聂黎行,孙焕,等.离子排斥色谱法测定生脉注射液中的有机酸[J].分析化学,2012,40（3）：489-490.

[12] 范小娜,黄玲,黄志勤,等.三种羟基羧酸气相色谱法的分离及定量分析[J].江西师范大学学报（自然科学版）,2004,28（6）：537-539.