土壤中不同硒含量对大豆中主要组成成分的影响

胡居吾，熊 华

(1.江西省科学院 应用化学研究所，江西 南昌 330096；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

硒在植物体内对植物蛋白质合成起着促进作用，同时，硒具有转运氨基酸的功能，使得植物体内的氨基酸组成也发生了变化[1]。Wan等[2]对茶叶、Yang等[3]对大豆、Sigrist等[4]对绿藻以及Sharifi等[5]对灵芝的研究均表明，在适量硒浓度范围内，硒均可提高这些植物体内蛋白质的合成。研究人员还研究了硒对大豆、大蒜、马铃薯、油菜以及菠菜和花椰菜等植物中其营养成分的影响，结果表明，适量的硒对于上述植株体内其他营养成分，如脂肪酸、维生素C、可溶性糖、叶绿素等成分的含量都有变化[6-8]。目前，大部分文献探索了人工喷施硒源对植物中营养成分的影响，但是，关于天然硒土壤中不同的硒含量对农作物中营养成分影响的研究不多。

本研究的目的在于掌握丰城市天然硒土壤中不同硒含量对大豆中主要组成成分的影响，包括大豆蛋白质和脂肪酸的含量、蛋白质的分子量分布和亚基组成、氨基酸组成以及对大豆油中脂肪酸组成等成分的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

原料采集：选择丰城市三个有代表性地区，这三个地区的土壤中含硒量不同，设为低硒区(A区，蕉坑村，硒含量0.124 mg/kg)、中硒区(B区，荷湖村，硒含量0.42 mg/kg)、高硒区(C区，董家村，硒含量0.941 mg/kg)。课题组研究结果显示，这三个地区土壤中除了硒含量不同外，土壤组成(如土壤中pH值、有机质、阳离子交换量等)、环境、气候无明显差异；同时，在这三个地区栽培的大豆品种相同，都为华夏1号(国审豆2006023)。采集这三个地区成熟的大豆作为研究对象，经检测这三个区的大豆中硒含量分别为0.034 mg/kg、0.081 mg/kg和0.142 mg/kg。

甲状腺球蛋白、醛缩酶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、过氧化物酶、腺苷酸激酶、肌红蛋白、核糖核酸酶 A、抑蛋白酶肽，购自美国Sigma公司；正己烷、NaOH、维生素 B12、磷酸钠、Tris、三氨基甲烷、甘氨酸、β-巯基乙醇、溴苯酚、丙烯酰胺/双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、硫酸铵、考马氏亮兰R-250、醋酸、甲醇、三氯乙酸、氢氧化钾，均购自国药集团化学试剂(上海)有限公司。

1.2 仪器与设备

BS210S分析天平，德国Sartorius公司；Flash EA 1112 NC凯氏定氮仪，美国Thermo公司；ST16高速离心机，美国Thermo公司；E2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；7890B高效气相色谱仪，美国安捷伦公司；A300全自动氨基酸分析仪，德国曼默博尔公司；Minn-Sub-Cell电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 对蛋白质和油脂含量的影响 (1)对蛋白质含量的影响。蛋白质含量的测定方法参照GB 50095-2010 食品安全国家标准“食品中蛋白质的测定”中的凯氏定氮法[9]。

(2)对油脂含量的影响。粗脂肪含量测定方法参照GB/T 14772—2008食品安全国家标准“食品中粗脂肪的测定”中的索氏提取法[10]进行测定。

1.3.2 不同含硒量对大豆蛋白分子量分布的影响 (1)大豆分离蛋白质的提取。以水∶大豆=10∶1的水料比，用1 mol/L NaOH调pH值至10.0，在磁力搅拌下提取时间为2 h；以4 500 r/min的转速离心15 min；滤渣再按上述条件下重复一次，合并两次的上清液。上清溶液用2 mol/L HCl调pH值调至等电点，静置过夜，离心，滤渣用水洗涤两次，再用NaOH调pH至7.0，溶液转入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得天然富硒大豆分离蛋白质样品。

(2)标准蛋白曲线的制作。将标准蛋白腺苷酸激酶(32 000)、甲状腺球蛋白(分子量为669 000道尔顿)、卵清蛋白(43 000)、醛缩酶(158 000)、维生素 B12(1 350)、过氧化物酶(40 200)、核糖核酸酶 A(13 700)、牛血清白蛋白(67 000)、肌红蛋白(17 000)、抑蛋白酶肽(6 500)分别配成1%的浓度，然后用高效液相色谱仪测定分子量，以保留时间为横坐标，蛋白的分子量为纵坐标，标准曲线如图1所示。

图1 标准蛋白曲线Fig.1 Standard protein curve

(3)蛋白分子量分布测定[11]。样品在4 500 r/min和25 ℃条件下离心15 min，上清溶液采用0.45 μm醋酸纤维微孔滤膜过滤，滤液稀释到0.2%的浓度，然后用高效液相色谱仪测定分子量色谱条件为：所使用的柱子是高分子蛋白分离柱、流动相流速为1 mL/min、流动相是50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7)，检测器在280 nm进行检测。

1.3.3 不同硒含量对大豆蛋白质亚基组成的影响 取50 mg大米蛋白质粉溶于1 mL电泳样品制备液。该制备液为0.06 mol/L Tris-HCI缓冲液，内含25%甘油(v/v)、2%SDS(w/v)、5% 2-ME(v/v)、0.1%溴酚蓝(w/v)，间隙振荡4 h，100 ℃水浴加热4 min，12 000 r/min离心10 min，上清液用于电泳[12]。

1.3.4 不同硒含量对大豆蛋白质中氨基酸组成的影响[13]总氨基酸的测定采用6 mol/L HCl真空水解样品24 h，采用三氯乙酸沉淀未水解蛋白质，10 000 r/min高速离心后测定。

色谱条件：安捷伦1 100液相色谱仪，自动衍生化反应及放置样品；荧光检测器，激发波长200～700 nm，发射波长280～900 nm；可变波长紫外检测器，波长190～600 nm；分析柱，Hypersil ODS C18(4×125)nm卡套柱。

1.3.5 不同硒含量对油脂中脂肪酸组成的影响 (1)总脂肪酸提取。采用正己烷作为萃取剂，在40 ℃恒温下，每次萃取2 h。

(2)样品脂肪酸甲酯化。准确称取1.000 g油脂样品，于洁净的锥形瓶中，加入10 mL正己烷，摇匀；取出1 mL，加入正己烷至15 mL，再加入4 mL乙酸甲酯，摇匀，再加入1 mL甲醇钠溶液，剧烈摇匀2 min，后在室温下反应20 min，再置于-20 ℃放置10 min，取出，加入1 mL草酸饱和溶液，摇匀。最后用无水Na2SO4过滤，滤液进行GC分析。

(3)气相色谱条件。Varian石英毛细管柱(φ0.32 mm×50 m×0.25 μm)，载气为高纯N2，流速为1.0 mL/min，进样口温度为250 ℃，升温程序：开始柱温为70 ℃，保持2 min后，以10 ℃/min升温，直至150 ℃后，保持1 min，再以10 ℃/min升温至220 ℃，保持10 min后，最后以20 ℃/min升温至250 ℃，保持15 min。

当物料为横观各向同性材料（秸秆类与木质类生物质原料）时，可以认为模孔内物料在同一截面内任意方向上具有相同力学特性，因此 Ey=Ez，νxy=νxz，νyx=νzx，由于弹性模量与泊松比之间存在如下关系：

2 结果与分析

2.1 不同硒含量对大豆蛋白质和油脂含量的影响

表1显示，大豆籽粒中的质白质的含量发生变化，在C区蛋白质含量(35.08%)比A区(34.81%)和B区(34.60%)蛋白质含量高，且有显著性差异。同时，油脂的含量随着硒含量的提高而下降，由A区的18.90%下降到16.51%，且有显著性差异。

硒对蛋白质含量的影响主要原因是半胱氨酸和蛋氨酸中含有硫元素，硒与硫竞争，硒取代硫元素与半胱氨酸和蛋氨酸结合，形成了硒代氨基酸化合物，部分或全部取代了蛋白质中游离的蛋氨酸和半胱氨酸后，硒被结合到蛋白质中，造成的蛋白质三级结构的变化，对蛋白质的合成产生了的影响[14]。

表1 不同硒含量对大豆蛋白质和油脂含量的影响Tab.1 Effect of on content of protein and fat content of different Se content in soybean

同列中不同小写字母表示显著差异(P<0.05)
Different lowercase letters in the same column meant significant differences(P<0.05)

由于在脂肪酸合成途径中，丙二酸单酰辅酶A(malonyl-CoA)是重要的参与合成时的三碳单元中间体，其中，硫元素是此辅酶的重要组成元素之一，若植物在生长的环境中存在着硒元素，则硒元素和硫元素存在着竞争关系，硒会替代硫元素与酶结合，降低了含硫酶活力，从而造成种子中油脂积累降低[15]，降低了油脂的含量。

硒对动、植物、微生物的必需性已得到确认，而且关于适宜的Se含量对农作物能起到改善品质和增加产量[16]。硒对多种作物的影响试验研究表明，适量硒肥具有明显的增产效果，如硒对大豆和水稻等农作物的影响实验，结果同样表明，同空白对照组相比，适量的硒含量对水稻和大豆的品质和产量方面都有一定的影响[17]。

2.2 不同硒含量对大豆蛋白质分子量分布的影响

本实验采用高分子蛋白质分离层析柱，对不同硒含量土壤种植的天然富硒大豆分离蛋白质的分子量进行了测定。排阻色谱图如图2所示。

图2 不同硒含量区的大豆蛋白分子量分布Fig.2 The distribution of soybean protein molecular quantity in different Se content area

由图2 A、B、C区可以看出，3个区的蛋白质分子量出峰时间是一样的，都大约在6 min，说明天然富硒土壤中不同的硒含量，不会改变天然富硒大豆蛋白质的种类。

表2 不同硒含量对大豆蛋白质分子量分布的影响Tab.2 Effects on protein molecular weight distribution in different Se contents soybean

2.3 不同硒含量对大豆蛋白质组成的影响

谱带1：A区大豆蛋白质；谱带2：B区大豆蛋白质；谱带3：C区大豆蛋白质Band 1:A region soybean protein;band 2:B region soybean protein;band 3:C region soybean protein图3 不同硒含量对大豆蛋白质组成的影响Fig.3 SDS-PAGE analysis of total soybean protein extracted from different Se content soybean

采用SDS-PAGE法研究了不同硒含量的土壤中对大豆蛋白质亚基组成的影响。结果如图3所示，不同的硒含量不会改变大豆蛋白质亚基组成。不同硒含量的蛋白SDS-PAGE图谱中，条带没有增加，也没有减少。通过研究表明，不同硒含量土壤中生长的大豆，在大豆蛋白质中，不同硒含量对蛋白质亚基的分布不会产生影响。但是，会对不同分子量的蛋白或肽链的浓度产生影响。

天然富硒大豆蛋白质与低硒大豆蛋白质的蛋白谱带基本相同，在谱带上没有蛋白谱带消失，同时，也没有新的蛋白谱带产生，这一现象是由于不同含量的硒被豆类植物从根系转运进入到植株内和果实中时，虽然由于硒含量的不同而影响了蛋白质合成速度，并且高硒含量会提高大豆籽粒中蛋白质的含量，但对蛋白质代谢的途径不会发生变化，这个结果与在富硒灵芝和富硒水稻研究中的结果一致[19]。

2.4 不同硒含量对大豆蛋白质中氨基酸组成的影响

表3所示，当土壤中硒含量越高，对大豆蛋白质中氨基酸组分影响最大的也是半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)。在低硒区(A区)大豆蛋白质中的半胱氨酸(Cys)含量为2.58%，而在高硒区(C区)的含量只有0.124%；在低硒区(A区)大豆蛋白质中的蛋氨酸(Met)含量为3.02%，而在高硒区(C区)的含量只有2.24%。

研究表明，硒元素进入植物体内是以两种方式来促进蛋白质合成和代谢[20]：一是无机硒进入植物体内后，硒通过植物器官转运进入植物体内后，与植物体内某些氨基酸相结合，尤其是含硫基的氨基酸，结合后形成硒代含硫氨基酸化合物或者其衍生物，如硒与半胱氨酸结合形成硒半胱氨酸(Se-Cys)，硒与蛋氨酸结合形成硒代蛋氨酸(Se-Met)，然后这些硒代含硫氨基酸化合物直接参与到植物蛋白质合成的过程中，从而使植物体内的游离氨基酸中半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)的含量降低(表3)。同时，对其它氨基酸，如色氨酸(Trp)和甘氨酸(Gly)的含量会随着硒含量的增大呈增加的趋势。

表4 不同硒含量对大豆油脂中脂肪酸组成的影响Tab.4 Effects on fatty acid composition of different Se content in soybean oil

a Unidentified fatty acids.b Total SFA:all saturated fatty acids (without any double bonds,C14:0-C26:0).c Total MUFA:all fatty acids with a single double bond (C12:1-C24:1).d Total n-3 PUFA:C18:3n3;C20:3n3;C20:5n3,C22:5n3,and C22:6n3.e Total n-6 PUFA:C18:2n6;C20:2n6;C20:3n6;C22:2n6,and C22:4n6

2.5 不同硒含量对大豆油脂中脂肪酸组成的影响

不同硒含量对大豆油脂的含量有一定的影响，且为负相关并有显著性差异(如表1所示)。虽然不同硒含量对大豆油脂中脂肪酸组成有一定的影响，但都没有显著性变化。

对不同硒含量的大豆油脂进行了气相色谱分析，如表4所示，不同硒含量的大豆油脂中十六酸、十七酸、二十碳酸、二十二碳烯酸的比例在数量上有些变化，如在这三个含硒量不同区的大豆油脂中十六酸含量分别为10.98%、11.02%和10.72%，但不存在显著性差异。总硬脂酸的含量会随着硒含量的增大而呈下降的趋势，这3个含硒量不同区的大豆油脂中总硬脂酸含量分别为18.00%、17.31%和16.04%。总n-3多不饱和脂肪酸(Tn-3PUFA)的含量也会随着硒含量的增大而呈上升趋势，含量分别为9.42%、9.62%和9.70%。同时，软脂酸和硬脂酸之间的比例会随硒含量的增大略呈上升趋势，而亚油酸和亚麻酸的之间的比例呈降低关系。在脂肪酸的代谢途径中，不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的代谢途径不同。饱和脂肪酸在脂肪酸的β氧化反应过程中，在脂肪酸的硫激酶(thiokinase)的起主要作用。不饱和脂肪酸需要的是烯酰-CoA异构酶(isomerase)和2,4-二烯酰-CoA(2,4-dienoyl-CoA redyctase)，而硒元素是烯酰-CoA异构酶(isomerase)和2,4-二烯酰-CoA的重要组成成分，硒含量的不同，这两种酶活性也不相同，因此，不同的硒含量对脂肪组中不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的含量存在着影响[21]。

3 结 论

(1)研究了土壤中不同硒含量对大豆中主要成分的影响。结果表明，随着硒含量的不同，C区(高硒区)大豆中蛋白质含量(35.08%)比A区(低硒区)出现显著性提高，而油脂的含量下降，由18.90%(A区)下降到16.52%(C区)。

(2)不同硒含量对大豆蛋白质分子量分布的影响，研究结果表明，硒含量的不同对于蛋白质的种类没有改变，但对大豆蛋白质分子量分布产生了影响。

(3)不同硒含量对大豆蛋白质组成和氨基酸组成的影响，结果表明，不同的硒含量不会改变大豆蛋白质亚基组成，从SDS-PAGE图谱中可以看出，条带没有增加，也没有减少。但是，对氨基酸组成有一定的影响，当土壤中硒含量越高，对大豆蛋白质中氨基酸组分影响最大的也是半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)。在低硒区(A区)大豆蛋白质中的半胱氨酸(Cys)含量为2.58%，而在高硒区(C区)的含量只有0.124%；在低硒区(A区)大豆蛋白质中的蛋氨酸(Met)含量为3.02%，而在高硒区(C区)的含量只有2.24%。

(4)不同含硒量对大豆脂肪酸组成的影响，结果表明，大豆油脂中十六酸、十七酸、二十碳酸、二十二碳酸的比例在数量上有些变化，但不存在显著性差异。软脂酸和硬脂酸之间的比例会随硒含量的增大略呈上升趋势，而亚油酸和亚麻酸的之间的比例呈降低关系。

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