两种真姬菇不同溶剂提取物的抗氧化活性研究

刘继攀,张紫华,关振华,刘文君,李佳欢,2,金文松,2,*,胡开辉,2,*

(1.福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002; 2.福建农林大学(古田)菌业研究院,福建宁德 352200)

自由基、化学反应和各种化合物的氧化还原反应可能导致蛋白质的变性、DNA损伤以及肝细胞中的脂质过氧化作用[1],而这些反应与许多慢性疾病,如糖尿病、癌症、动脉粥样硬化、心血管疾病等密切相关[2]。天然抗氧化剂广泛存在于水果、茶叶、蔬菜、谷物与药用植物中。天然抗氧化剂具有清除自由基的能力,更为重要的是,相较于合成型抗氧化剂，比如丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)与叔丁基对苯二酚(TBHQ),天然抗氧化剂被认为是一种低毒,甚至无毒型的抗氧化剂。因此,从各种食用菌中发掘天然抗氧化剂成为食品科学领域的一个研究热点。

真姬菇(Hypsizygusmarmoreus),学名斑玉蕈,是一种高蛋白、低脂肪、低热量的食药兼用菌[3]。Yu等[4]采用共轭二烯、DPPH自由基清除能力、还原力、羟基自由基清除能力、亚铁离子螯合能力及铜离子螯合能力的方法分别对真姬菇甲醇、冷水与热水粗提物的抗氧化活性进行了分析,发现真姬菇的三种粗提物均具有一定的抗氧化活性。另外一项研究成果同样来自于Yu等[5],他们分析了真姬菇白色变种的甲醇与热水粗提物的抗氧化活性,研究发现真姬菇白色变种的甲醇与热水粗提物也均具有一定的抗氧化活性。通过测定甲醇与热水粗提物中β-胡萝卜素、α-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚与多酚的含量,结合甲醇与热水粗提物的抗氧化活性数据,分析了粗提物中β-胡萝卜素、α-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚与多酚含量分别与抗氧化活性之间的相关性。同时,这两项研究结果表明真姬菇不同品种之间所含的抗氧化物质种类、抗氧化物质含量可能存在很大的差异。王丽威等[6]通过提取真姬菇多酚粗提物,发现真姬菇多酚具有清除DPPH自由基的能力。前人的研究成果表明尽管不同品种的真姬菇所含的抗氧化物质可能存在较大差异,但都具有一定的抗氧化活性。

本课题组应用原生质体融合技术融合真姬菇与凤尾菇的原生质体,基于漆酶筛选体系,获得一株新的真姬菇高产菌株[7]并命名为闽真2号。应用白玉菇和灰蟹菇作为亲本,结合分子标记和原生质体单核化杂交育种技术选育出生产性状优良的真姬菇新菌株并命名为闽真3号。本研究采用80%甲醇分别对闽真2号真姬菇与闽真3号真姬菇进行浸提,再分别用正已烷、乙酸乙酯、正丁醇对粗提物进行萃取。应用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力与总抗氧化能力的方法分析闽真2号真姬菇与闽真3号真姬菇各种萃取物的抗氧化活性。研究结果将为闽真2号真姬菇与闽真3号真姬菇作为天然抗氧化剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

闽真2号真姬菇、闽真3号真姬菇 由福建古田福泉鑫生物科技有限公司提供,烘干、粉碎后装于密封袋中备用;没食子酸(纯度≥99.0%) 上海麦克林生化科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,纯度≥97.0%) 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS,纯度≥98.0%) 北京索莱宝科技有限公司;甲醇、十二水合磷酸钠、浓硫酸、无水碳酸钠、Folin-Ciocalteu试剂、四水合钼酸铵等药品 均为国产分析纯。

N-1300D型旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司;3020型多功能酶标仪 赛默飞世尔科技公司;CA-1115A型冷却水循环装置 上海爱朗仪器有限公司;LGJ-12型真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技有限公司;DK-S24型电热恒温水浴锅 上海一恒科技仪器有限公司;HZC-250型全温振荡培养箱 苏州培英实验设备有限公司;AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物的制备 真姬菇鲜品在50 ℃条件下,烘24 h使其干燥,粉碎,过60目筛,制得真姬菇干粉。通过预实验可知80%甲醇作为提取剂时,抗氧化活性比较强;液料比为8∶1 (mL∶g)时,提取率较高。为此,称取100 g干粉,放入1 L的三角瓶中,加入800 mL体积分数为80%的甲醇,液料比8∶1 (mL∶g),置于40 ℃的恒温摇床(180 r/min)浸提8 h,抽滤得到提取液,浸提操作重复3次,合并提取液,旋蒸浓缩,浸膏置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥,制得真姬菇粗提物。

将粗提物用适量蒸馏水悬浮,将其倒入分液漏斗中,按体积比1∶1加入正己烷,振荡,静止12 h,分液,上层液体倒入烧杯中,得到正己烷萃取液,下层液体按体积比1∶1加入新的正己烷,正己烷萃取操作重复3次,合并正己烷萃取液,旋蒸浓缩,浸膏置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥得到正己烷萃取物。采用相同的技术路线制备乙酸乙酯萃取物与正丁醇萃取物;正丁醇萃余物为水萃取物[8]。最后称取各种萃取物的质量,并计算不同溶剂提取物的提取率,计算公式如下:

式中:m1为不同溶剂萃取物的质量(mg);m2为粗提物的质量(mg)。

1.2.2 抗氧化活性的测定

1.2.2.1 总抗氧化能力的测定 按照梁引库等[9]的测定方法,磷钼试剂的配制:分别称取1.064 g十二水合磷酸钠、0.494 g四水合钼酸铵、3.335 mL浓硫酸共同溶于100 mL水中,混合均匀,使其浓度依次为28,4 mmol/L和0.6 mol/L。配制不同质量浓度的萃取物,将0.2 mL待测样品加入到1.8 mL磷钼试剂中,将混合液混匀并置于95 ℃恒温水浴锅中水浴90 min,反应液冷却后取200 μL置于695 nm处测定吸光值,平行测定3次,取其平均值。

1.2.2.2 DPPH自由基清除能力的测定 测定方法参考Ma,Ke等[10]文献的报道,稍作改动。将100 μL不同质量浓度的萃取物与100 μL的甲醇-DPPH自由基(终浓度为0.1 mmol/L)充分混匀后,避光处反应30 min,最后用多功能酶标仪在517 nm处测定反应体系的吸光值,平行测定3次,取其平均值。DPPH自由基清除率的计算公式为:清除率(%)=[(A517 nm空白对照-A517样品)/A517 nm空白对照]×100。

1.2.2.3 ABTS自由基清除能力的测定 根据Ksouri R等[11]的方法进行测定,稍作改动。吸取5 mL,14 mmol/L的ABTS和5 mL,4.9 mmol/L的过硫酸钾溶液,振荡混匀,使其终浓度分别为7.0、2.45 mmol/L的储备液,并将该储备液于室温下暗处静置12～16 h。将生成的储备液用80%甲醇稀释至734 nm处吸光值为0.7±0.02的工作液。反应体系于96孔板中加入20 μL不同质量浓度的萃取物,再加入180 μL ABTS工作液,于室温下避光反应10 min,测定反应液在734 nm处的吸光值,平行测定3次,取其平均值。计算ABTS自由基清除率,公式如下:ABTS自由基清除率(%)=(1-A734 nm样品/A734 nm空白对照)×100。

1.2.3 多酚含量的测定 测定方法参照张梅梅等[12]的文献,准确配制0.08 mg/mL没食子酸标准液,分别吸取没食子酸标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL,加入0.3 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu试剂,避光反应8 min,再加入0.6 mL 10%(M/V)Na2CO3溶液,混匀后室温下避光反应30 min,用去离子水定容至5.0 mL,于750 nm处测定吸光值。平行测定3次,取其平均值。以反应体系中没食子酸标准品溶液的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标作标准曲线,回归方程为:y=0.1047x+0.0153,R2=0.9986。取不同溶剂萃取物测定多酚含量,根据标准曲线回归方程式计算多酚含量,其结果表示为每克萃取物中没食子酸的当量毫克数(gallic acid equivalent,GAE),即mg GAE。

1.2.4 数据处理 采用Origin 8.5和SPSS 21.0数据处理软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 真姬菇不同溶剂萃取物提取率

由表1可知,闽真2号与闽真3号粗提物的提取率分别为46.30%、51.33%,粗提物经正已烷、乙酸乙酯与正丁醇萃取后,不同极性的物质在不同的有机萃取剂中呈现相同的分布趋势,萃取率由大到小为:水萃取物>正己烷萃取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物。闽真2号与闽真3号水萃取物的萃取率分别达到83.84%、86.85%,说明真姬菇粗提物主要由大极性的物质构成。

表1 不同溶剂萃取物的提取率(%)Table 1 The extraction yields of various solvent extracts(%)

2.2 真姬菇不同溶剂萃取物抗氧化活性的测定

2.2.1 总抗氧化能力的测定 由图1可知,闽真2号和闽真3号粗提物与四种萃取物的浓度在1.25～20 mg/mL范围内,它们的总抗氧化能力随着粗提物或萃取物浓度的增加而增加。闽真2号粗提物、正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物与水萃取物总抗氧化能力的IC50值分别为13.94±0.19、2.18±0.14、2.47±0.09、11.48±0.08与23.98±0.45 mg/mL(表2),其中,正己烷萃取物与乙酸乙酯萃取物的总抗氧化能力之间差异不显著(p>0.05),但与粗提物、正丁醇萃取物与水萃取物的总抗氧化能力之间差异均达显著水平(p<0.05)。闽真3号粗提物、正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物与水萃取物总抗氧化能力的IC50值分别为14.44±0.17、4.10±0.21、3.12±0.05、11.97±0.10与19.76±0.75 mg/mL,且萃取物之间的总抗氧化能力差异均达显著水平(p<0.05)(表2)。阳性对照维生素C的IC50值为0.16±0.002 mg/mL(表2)。闽真2号正己烷萃取物的总抗氧化能力最强,而闽真3号乙酸乙酯萃取物的总抗氧化能力最强。在总抗氧化能力方面,闽真2号稍微优于闽真3号,但都明显弱于维生素C。此外,实验结果也表明闽真2号和闽真3号发挥总抗氧化能力的物质主要是中小极性的物质,较大极性物质的总抗氧化能力弱。

图1 闽真2号和闽真3号各萃取物的总抗氧化能力分析Fig.1 Assays for total antioxidant activities of various solvent extracts of MinZhen No.2 and MinZhen No.3

2.2.2 DPPH自由基清除能力的测定 由图2可知,除正丁醇萃取物之外,粗提物、正已烷萃取物、乙酸乙酯萃取物与水萃取物清除DPPH自由基的能力均随着测试物浓度的增加而增加。闽真2号粗提物、正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物与水萃取物清除DPPH自由基的IC50值分别为5.84±0.17、4.97±0.15、3.46±0.25与6.94±0.10 mg/mL,在测试的浓度范围之内,正丁醇萃取物对DPPH自由基的清除率未达50%,各种萃取物清除DPPH自由基能力之间的差异性均达显著水平(p<0.05),其中乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基的效果最好(表2)。闽真3号粗提物、正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物与水萃取物清除DPPH自由基的IC50值分别为6.07±0.31、4.74±0.02、0.83±0.01、1.96±0.11与3.57±0.06 mg/mL,乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基的效果最好(表2)。与总抗氧化能力分析结果相同,闽真2号清除DPPH自由基的能力强于闽真3号清除DPPH自由基的能力(表2),但是两者清除DPPH自由基的能力都弱于维生素C。然而,闽真2号和闽真3号各种萃取物清除DPPH自由基能力的趋势不同,闽真2号各种萃取物清除DPPH自由基能力的趋势为:乙酸乙酯萃取物>正己烷萃取物>粗提物>水萃取物>正丁醇萃取物,闽真3号各种萃取物清除DPPH自由基能力的趋势为:乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>水萃取物>正己烷萃取物>粗提物。实验结果表明闽真2号和闽真3号中具有清除DPPH自由基的物质都是中小极性的化合物。

表2 不同溶剂萃取物抗氧化活性的IC50值(mg/mL)Table 2 IC50 values of antioxidant properties of various solvent extracts(mg/mL)

图2 闽真2号和闽真3号各萃取物 清除DPPH自由基的能力分析Fig.2 Assays for DPPH radical scavenging activities of various solvent extracts of MinZhen No.2 and MinZhen No.3

2.2.3 ABTS自由基清除能力的测定 如图3所示,各种萃取物对ABTS自由基均表现出良好的清除能力,且清除能力成量效正相关。闽真2号各种萃取物清除ABTS自由基能力的趋势为:正丁醇萃取物>水萃取物>粗提物>乙酸乙酯萃取物>正已烷萃取物;闽真3号各种萃取物清除ABTS自由基能力的趋势为:乙酸乙酯萃取>正丁醇萃取物>水萃取物>粗提物>正已烷萃取物(表2)。就清除ABTS自由基能力而言,闽真3号优于闽真2号,但是两者都弱于维生素C。实验结果表明闽真2号和闽真3号中具有清除ABTS自由基的物质主要为中大极性的物质,小极性物质清除ABTS自由基的能力较弱。

图3 闽真2号和闽真3号各萃取物 清除ABTS自由基的能力分析Fig.3 Assays for ABTS radical scavenging activities of various solvent extracts of MinZhen No.2 and MinZhen No.3

2.3 真姬菇不同溶剂萃取物多酚含量

可食用或者不可食用的真菌通常发现包含多种类型的多酚。据报导多酚具有多种生物学功能,包括抗氧化活性,多酚的抗氧化活性主要由于它们的氧化还原特性决定的[13]。本研究以没食子酸为标准物,Folin-Ciocalteu法分别测定闽真2号与闽真3号各种萃取物中多酚的含量,以期分析萃取物多酚含量与萃取物的抗氧化活性之间的相关性。闽真2号各种萃取物多酚含量的趋势为:正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>正己烷萃取物>粗提物>水萃取物;闽真3号各种萃取物多酚含量的趋势为:乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>粗提物>正己烷萃取物>水萃取物(表3)。闽真3号多酚含量稍微多于闽真2号多酚含量。

表3 不同溶剂萃取物的多酚含量(mg/g萃取物)Table 3 Total polyphenol contents of various solvent extracts(mg/g extracts)

2.4 抗氧化活性与多酚含量的相关性

线性回归分析萃取物多酚含量与萃取物的抗氧化活性之间的相关性,结果表明闽真2号多酚含量和总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力的相关系数分别为0.1665、0.7701、0.1386;闽真3号多酚含量和总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力的相关系数分别为0.2743、0.7954、0.4230。相关性分析结果表明多酚含量与清除DPPH自由基能力之间具有较好的相关性,说明萃取物中多酚是发挥清除DPPH自由基的主要成分;然而,多酚含量与总抗氧化能力、清除ABTS自由基能力之间的相关性较差(表4),说明萃取物中发挥总抗氧能力与清除ABTS自由基能力可能主要是非多酚物质,如萜类化合物、生育酚等。

表4 抗氧化活性的IC50值与多酚含量的相关性Table 4 Correlation between IC50 values of antioxidant properties and total polyphenol contents

3 讨论与结论

本研究应用80%甲醇浸提真姬菇两个新品种(闽真2号、闽真3号)中的功能性物质,再用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇分别对粗提物进行萃取,分别制得正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物与水萃取物。由于食用菌提取物的活性物质具有多种成分,粗提物或萃取物的抗氧化活性不能仅仅通过单一方法进行评估,因此本研究采用3种分析方法,包括总抗氧能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力,分析闽真2号与闽真3号各种萃取物的抗氧化活性。研究结果表明中小极性的物质比中大极性的物质具有较强的总抗氧化能力与清除DPPH自由基能力;而中大极性的物质清除ABTS自由基的能力略优于中小极性的物质清除ABTS自由基能力。尽管水萃取物占总萃取物的比例达80%以上,但其抗氧化活性明显比正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物与正丁醇萃取物的抗氧化活性弱,表明真姬菇中主要的抗氧化物质成分是中小极性物质。通过测定闽真2号与闽真3号各种萃取物中的多酚含量,结合萃取物的抗氧化活性数据(IC50),分析多酚含量与抗氧化活性之间的相关性。相关性分析结果表明多酚含量仅与清除DPPH自由基能力之间具有较好的相关性,本研究结果与Yu等[5]的研究结果相矛盾,他们分析的真姬菇品种中多酚含量与清除DPPH自由基能力之间不具有相关性,结果差异性可能源自于不同的真姬菇品种所含的多酚类型可能存在差异性。多酚含量与总抗氧化能力之间相关性差,这与Sahreen等[14]的研究结果相一致。据报导,植物提取物中多酚含量与抗氧化活性成正相关[14-17]。然而,多酚含量与抗氧化活性之间的相关性一直存在争议,正如Maria A等[18]报道的一样,他们发现甜橙皮不同提取物多酚含量不与它们清除自由基的能力成正比,类似的现象也存在于其他研究成果[5,19]。真姬菇粗提物与四种萃取物中多酚含量与抗氧化活性之间的关系呈现复杂性,导致这种现象的原因可能有以下两个:不同的萃取溶剂会萃取不同的活性物质,从而导致它们的抗氧化活性呈现差异性;由于用于分析抗氧化活性的方法基于不同的机理与条件,方法之间可能会呈现不同的结果,每一种方法也许只能够部分地反应测试物的抗氧化活性。

总体而言,闽真2号真姬菇与闽真3号真姬菇的粗提物与四种萃取物都具有一定的抗氧化活性,特别是正己烷萃取物与乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性较好,具有开发成天然抗氧化剂的潜能。

[1]Morrissey P A,O’brien N M. Dietary antioxidants in health and disease[J]. International Dairy Journal,1998,8(5):463-472.

[2]Wan C,Yu Y,Zhou S,et al. Antioxidant activity and free radical-scavenging capacity ofGynuradivaricataleaf extracts at different temperatures[J]. Pharmacogn Mag,2011,7(25):40-45.

[3]郑峻,林友照,胡开辉. 真姬菇工厂化栽培关键技术[J]. 福建农业,2006(8):18-19.

[4]Lee Y-L,Yen M-T,Mau J-L. Antioxidant properties of various extracts fromHypsizigusmarmoreus[J]. Food Chemistry,2007,104(1):1-9.

[5]Lee Y-L,Han S-Y,Lian P-Y,et al. Antioxidant properties of extracts from a white mutant of the mushroomHypsizigusmarmoreus[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2008,21(2):116-124.

[6]王丽威,岳喜庆,刘政,等. 真姬菇多酚的微波辅助提取及清除DPPH自由基活性的研究[J]. 食品工业科技,2013(8):253-256，261.

[7]Sun S,Li X,Ruan L,et al. A novel breeding strategy for new strains ofHypsizygusmarmoreusandGrifolafrondosabased on ligninolytic enzymes[J]. World J Microbiol Biotechnol,2014,30(7):2005.

[8]Kil H Y,Seong E S,Ghimire B K,et al. Antioxidant and antimicrobial activities of crude sorghum extract[J]. Food Chemistry,2009,115(4):1234-1239.

[9]梁引库,王琦,李新生. 黑米花青苷胶囊体外清除自由基及抗氧化作用的研究[J]. 食品科技,2012(8):243-246.

[10]Ma K,Han J,Bao L,et al. Two sarcoviolins with antioxidative and alpha-glucosidase inhibitory activity from the edible mushroomSarcodonleucopuscollected in Tibet[J]. J Nat Prod,2014,77(4):942-947.

[11]Ksouri R,Falleh H,Megdiche W,et al. Antioxidant and antimicrobial activities of the edible medicinal halophyteTamarixgallicaL. and related polyphenolic constituents[J]. Food and Chemical Toxicology,2009,47(8):2083-2091.

[12]张梅梅,魏志文,刘玉冰,等. Folin-Ciocalteu比色法测定桦褐孔菌多酚的条件优化[J]. 菌物学报,2011(2):295-304.

[13]Ajila C M,Brar S K,Verma M,et al. Extraction and analysis of polyphenols:Recent trends[J]. Crit Rev Biotechnol,2011,31(3):227.

[14]Sahreen S,Khan M R,Khan R A. Evaluation of antioxidant activities of various solvent extracts ofCarissaopacafruits[J]. Food Chemistry,2010,122(4):1205-1211.

[15]Yikling C,Jookheng G,Yauyan L. Assessment ofinvitroantioxidant capacity and polyphenolic composition of selected medicinal herbs from Leguminosae family in Peninsular Malaysia[J]. Food Chem,2009,116(1):13-18.

[16]Liu S C,Lin J T,Wang C K,et al. Antioxidant properties of various solvent extracts from lychee(LitchichinenesisSonn.)flowers[J]. Food Chem,2009,114(2):577-581.

[17]Gheldof N,Engeseth N J. Antioxidant capacity of honeys from various floral sources based on the determination of oxygen radical absorbance capacity and inhibition ofinvitrolipoprotein oxidation in human serum samples[J]. J Agric Food Chem,2002,50(10):3050-3055.

[18]Anagnostopoulou M A,Kefalas P,Papageorgiou V P,et al. Radical scavenging activity of various extracts and fractions of sweet orange peel(Citrussinensis)[J]. Food Chem,2006,94(1):19-25.

[19]Yu L,Haley S,Perret J,et al. Free radical scavenging properties of wheat extracts[J]. J Agric Food Chem,2002,50(6):1619-1624.