超高压辅助制备老蒜提取物工艺研究

刘 畅,刘 锐,3,吴 涛,3,张 民,3,*

(1.省部共建食品营养与安全国家重点实验室,天津 300457; 2.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457； 3.天津食品安全低碳制造协同创新中心,天津 300457)

大蒜(Allium Sativum)为百合科葱属植物生蒜的地下鳞茎,原产于西亚和中亚一带,世界各国均有分布[1-2]。我国大蒜资源丰富,据统计,日本和东南亚市场上80%的大蒜来自我国[3]。现代医学研究表明,大蒜具有丰富的生物活性功能,如抗氧化、预防心血管疾病、增强免疫功能、抑菌、抗肿瘤、预防糖尿病、保护肝脏等[4-6]。老蒜提取物(AGE)作为一种大蒜精深加工产品,具有良好的抗氧化能力,对糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆症等疾病的预防等具有积极作用[7-9];而且相对其它大蒜制品,AGE刺激性低,即使高剂量使用也是无害的,具有良好的食用安全性,可用于膳食补充剂,已得到国内外广泛关注。

目前,AGE生产普遍采用Wakunaga制药有限公司建立的工艺,具体是将新鲜大蒜蒜片在室温下用15%～25%的乙醇水溶液浸泡10个月或者20个月以上,过滤后的浸提液经减压低温浓缩后得到AGE[10],符合商业老蒜提取物中SAC含量为1.6～2.4 g/kg(干重)的标准[11]。但该方法存在生产周期较长的问题,同时乙醇浓度较高,生产成本也随之增加。本课题组[12]前期研究制备了两种老蒜提取物,一种是将新鲜大蒜去皮、切片后,以1∶6 g·mL-1的料液比浸泡于乙醇浓度为10%(v/v)的溶液中,室温条件下避光浸泡90 d后浓缩所得,其SAC含量为1.6 g/kg(干重);另一种是将新鲜大蒜去皮、切片后以1∶6 g·mL-1的料液比浸泡于蒸馏水中,室温条件下避光浸泡20 d浓缩所得,其SAC含量为1.8 g/kg(干重)。上述方法均为直接溶剂浸提法,显著缩短了生产周期,同时降低了乙醇溶液浓度。

为了进一步优化老蒜提取物生产工艺,本文拟采用超高压辅助浸提法,研究不同超高压处理条件对老蒜提取物的抗氧化活性的影响,结合老蒜提取物制备过程中主要功能成分含量的变化,考察浸泡时间对老蒜提取物制备的影响,确定一种超高压辅助制备老蒜提取物的工艺方法,旨在缩短生产周期,降低乙醇溶液浓度或提高SAC活性成分含量,从而为老蒜产品的研究与开发提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普通白皮大蒜 山东莱芜;浓硫酸、浓盐酸 天津国药集团有限公司;无水乙醇 天津市江天化工技术有限公司;甲醇 天津市康科德科技有限公司 色谱纯;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,4,6-三吡啶基三嗪 美国Sigma公司;蒜氨酸标准品、S-烯丙基半胱氨酸标准品 美国Fluka公司,≥90%;无特殊说明均为分析纯试剂。

HPP.L2-600/0.6超高压设备 天津华泰森淼生物工程技术有限公司;TU-1810 PC型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;LC-20AT高效液相色谱仪泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-20A紫外检测器 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超高压辅助制备大蒜提取物 将新鲜大蒜去皮、切片,按一定料液比立即浸泡于一定浓度的乙醇溶液中,在室温条件下进行超高压处理,超高压处理后的液体溶液经定性滤纸常压过滤后即为目标大蒜提取物,通过测定大蒜提取物的DPPH·清除率、·OH清除率、总抗氧化能力等确定提取条件[13-14],分别考察超高压处理压力(100、200、300、400、500、600 MPa)、保压时间(1、3、5、7、9、11 min)、乙醇浓度(0%、10%、20%、30%、40%,均为v/v)、料液比(1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15 g·mL-1)对浸提液抗氧化活性的影响,固定的因素及水平为：处理温度为室温，超高压处理压力为300 MPa，保压时间为30 min,乙醇浓度为10%，料液比为1∶6 g·mL-1。

1.2.2 老蒜提取物的制备 结合大蒜提取物超高压单因素实验结果,考察浸泡时间对老蒜提取物制备过程中抗氧化活性的影响,配制相同浓度(0.024 mg/mL)抗坏血酸溶液作为对照,以浸提液抗氧化测定数据占抗坏血酸溶液测定数据比例为结果。以处理压力200、300、400 MPa,保压时间5 min,料液比1∶9 g·mL-1,乙醇浓度10%(v/v)作为处理条件,并以未经超高压处理直接浸泡作为对照,每隔5 d取样,分别测定DPPH·清除率、·OH清除率、总抗氧化能力等抗氧化活性,S-烯丙基半胱氨酸、S-烯丙基半胱氨酸亚砜、总糖等功能成分含量,从而确定浸泡时间。

1.2.3 DPPH·清除率实验 配制0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液:准确称取7.89 mg DPPH溶于少量无水乙醇中,定容至100 mL,即得。各组加样分别为:吸取3.0 mL DPPH乙醇溶液,加入3.0 mL样品溶剂,记为Ac;吸取3.0 mL DPPH乙醇溶液,加入3.0 mL样品溶剂,记为As;吸取3.0 mL无水乙醇溶液,加入3.0 mL样品溶剂,记为Ab。室温避光反应20 min,于517 nm处测定各组吸光度值,每组样品测定3个平行[15]。根据下列公式计算得到清除率。

DPPH·清除率(%)=(1-(As-Ab)/Ac)×100

1.2.4 ·OH清除率实验 采用Fenton反应体系,·OH由EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2体系产生。由于·OH可特异性地使番红花红T褪色,可根据番红花红T褪色程度用比色法测定·OH清除率。分别配制pH7.4的磷酸盐缓冲溶液,1 mmol/L番红花红T溶液,4 mmol/L硫酸亚铁溶液、4 mmol/L EDTA-2Na溶液,3% H2O2溶液。将4 mmol/L EDTA-2Na溶液和4 mmol/L硫酸亚铁溶液等体积混合得到2 mmol/L EDTA-Fe储备液。各组分别按照顺序加样:2.0 mL磷酸盐缓冲溶液,0.2 mL番红花红T,2.0 mL 3%H2O2,2.0 mL EDTA-Na2-Fe(Ⅱ),2.0 mL样品溶剂,记为A0;2.0 mL磷酸盐缓冲溶液,0.2 mL番红花红T,2.0 mL 3% H2O2,2.0 mL蒸馏水,2.0 mL样品溶剂,记为Ai;2.0 mL磷酸盐缓冲溶液,0.2 mL番红花红T,2.0 mL 3% H2O2,2.0 mL EDTA-Na2-Fe(Ⅱ),2.0 mL样品溶液,记为A。将各组混合均匀后,在37 ℃条件下水浴30 min,于520 nm处测定吸光度值,每组样品测定3个平行。根据下列公式计算得到清除率。

·OH清除率(%)=((A-A0)/(Ai-A0))×100

1.2.5 总抗氧化能力测定 采用FRAP法测定总抗氧化能力[15]。分别配制0.3 mol/L醋酸钠缓冲溶液,40 mmol/L盐酸溶液,20 mmol/L氯化铁溶液,10 mmol/L TPTZ溶液;再以10∶1∶1的体积比取0.3 mol/L醋酸钠缓冲溶液,20 mmol/L氯化铁溶液,10 mmol/L TPTZ溶液均匀混合,得到FRAP工作液,使用前放置于37 ℃水浴中保温。吸取0.2 mL样品溶液,再加入5.0 mL预热好的FRAP工作液,混匀后室温放置10 min,于593 nm处测定吸光度值,每组样品3个平行。同时,配制一系列浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L的FeSO4标准溶液代替样品溶液作标准曲线,以FeSO4浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,得到标准曲线回归方程。对应回归方程计算出浸提液的FRAP值,从而得到样品抗氧化能力的强弱。

1.2.6 总糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[17]。配制6%重蒸苯酚。准确称取干燥至恒重的果糖10 mg,加蒸馏水定容至100 mL,得到100 μg/mL果糖对照品溶液,分别吸取果糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL,各加入蒸馏水均补至2.0 mL,然后加入1.0 mL 6%重蒸苯酚,混合均匀后加入浓硫酸5.0 mL,摇匀后室温放置20 min,于490 nm处测定吸光度值。同时以2.0 mL蒸馏水替代标准溶液按同样显色方法操作为空白作标准曲线,以果糖质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,得到标准曲线回归方程。同样方法测定样品溶液中总糖含量。

1.2.7 S-烯丙基半胱氨酸(SAC)含量测定 采用高效液相色谱法测定SAC含量[12]。准确称取一定质量的SAC标准品溶于色谱甲醇中,以流动相稀释至一系列浓度为25、50、100、200、300、400、500、600、700 μg/mL的标准品溶液,经0.22 μm有机系滤膜过滤后进行测定。液相色谱条件为流动相V(甲醇)∶V(水)=10∶90,流速为0.8 mL/min,色谱柱为Kromasil 100-5 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),二元高压洗脱,紫外检测器,检测波长220 nm,进样量20 μL。按照上述色谱条件测定后,以峰面积积分值A为横坐标,SAC浓度C为纵坐标,得到标准曲线回归方程。同样方法测定样品溶液中SAC含量。

1.2.8 S-烯丙基半胱氨酸亚砜(SACS)含量测定 采用高效液相色谱法测定SACS含量[3]。准确称取一定质量的SACS标准品溶于色谱甲醇中,以流动相稀释至一系列浓度为90、150、225、300、450、600、750 μg/mL的标准品溶液,经0.22 μm有机系滤膜过滤后进行测定。液相色谱条件为流动相V(甲醇)∶V(水)=20∶80,流速为0.8 mL/min,色谱柱为Kromasil 100-5 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),二元高压洗脱,紫外检测器,检测波长214 nm,进样量20 μL。按照上述色谱条件测定后,以峰面积积分值A为横坐标,SACS浓度C为纵坐标,得到标准曲线回归方程。同样方法测定样品溶液中SACS含量。

1.3 数据统计分析

实验数据均用平均数±标准差的形式表示,使用origin 8.5进行数据处理作图,实验数据组间比较采用One-way ANOVA进行显著性分析,p<0.05为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 超高压辅助制备老蒜提取物处理条件的确定

2.1.1 超高压处理压力对浸提液抗氧化活性的影响 由表1可知,随着超高压处理压力的增加,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率及总抗氧化能力均呈先上升后下降的趋势。当处理压力为300 MPa时,DPPH·清除率最高,可达到89.50%;·OH清除率在较低处理压力具有较高的清除率,当处理压力为100 MPa时,·OH清除率最高为80.67%;而浸提液总抗氧化能力与DPPH·清除率结果一致,当处理压力为300 MPa时最高,FRAP值达到0.534 mmol/L。结果表明,经过超高压处理后,浸提液抗氧化活性均较未处理样品明显提高,不同处理压力对浸提液DPPH·清除率、·OH清除率及总抗氧化能力等抗氧化活性影响程度不同。

表1 处理压力对浸提液抗氧化活性的影响Table 1 Effect of treatment pressure on the antioxidant activities of extracts

综合分析超高压处理压力对浸提液抗氧化活性结果可知,浸提液DPPH·清除率与总抗氧化能力的变化趋势一致,均在300 MPa下为最优,而·OH清除率随处理压力变化规律不明显,无法确定最优的超高压处理压力。因此,选取DPPH·清除率和总抗氧化能力均较高的处理压力200、300和400 MPa,在随后考察浸泡时间对老蒜提取物产品影响时,进一步以老蒜提取物中SAC含量为指标,确定超高压处理压力最优条件。

2.1.2 超高压保压时间对浸提液抗氧化活性的影响 由表2可知,随着保压时间的延长,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率和总抗氧化能力均呈波动变化,当保压时间为5 min时,DPPH·清除率、·OH清除率和总抗氧化能力均处于较高水平,分别为87.13%、80.44%和0.239 mmol/L。因此,最佳保压时间5 min作为处理条件。与不同超高压处理压力结果一致,经过超高压处理后,浸提液抗氧化活性均较未处理样品明显提高。

表2 保压时间对浸提液抗氧化活性的影响Table 2 Effect of holding time on the antioxidant activities of extracts

2.1.3 乙醇浓度对浸提液抗氧化活性的影响 由表3可知,随着乙醇浓度的增大,浸提液DPPH·清除率和总抗氧化能力均呈现先上升后下降的趋势,当乙醇浓度10% 时,DPPH·清除率和FRAP值分别可达到85.59%和0.227 mmol/L;浸提液·OH清除率随乙醇浓度的增大呈下降的趋势,蒸馏水作为浸提溶剂时,·OH清除率为37.74%。结果表明,较高的乙醇浓度会使浸提液抗氧化活性降低。然而,根据课题组前期研究结果,当采用蒸馏水作为溶剂进行老蒜提取物制备时,虽然SAC含量有所上升,但SACS含量较乙醇溶液作为浸提液时有所降低[12]。综合上述结果,选择10%乙醇溶液作为浸提溶剂。此时,浸提液各项抗氧化活性指标均处于较高水平。

表3 乙醇浓度对浸提液抗氧化活性的影响Table 3 Effect of ethanol concentration on the antioxidant activities of extracts

2.1.4 料液比对浸提液抗氧化活性的影响 由表4可知,随着料液比的逐渐增大,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率和总抗氧化能力均呈现先上升后下降的趋势。当料液比为1∶9 g·mL-1时,DPPH·清除率、·OH清除率和FRAP值均最高,分别达到68.70%,28.01%和0.119 mmol/L。结果表明,料液比对老蒜提取物抗氧化活性影响较大,随着料液比的增大,有利于超高压处理对活性成分的提取,这可能是由于在高压状态下料液比过低,体系中溶剂的流动性受到一定的束缚,从而抑制了活性成分的扩散与运动;当料液比过高时,即反应体系中底物浓度过低,会抑制γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶等参与的酶促反应的反应速率,同时料液比增大使得溶剂使用和后期溶剂浓缩成本提高[18]。因此,选择料液比1∶9 g·mL-1作为处理条件。该条件下,浸提液各项抗氧化活性均处于较高水平。

表4 料液比对浸提液抗氧化活性的影响Table 4 Effect of solid to liquid radio on the antioxidant activities of extracts

2.2 浸泡时间对老蒜提取物性质的影响及浸泡时间的确定

2.2.1 浸泡时间对老蒜提取物抗氧化活性的影响 由图1可知,随着浸泡时间的延长,各组浸提液DPPH·清除率在前20 d显著下降,随后趋于平缓,并且经200 MPa处理的浸提液DPPH·清除率高于其它处理压力下的各组浸提液;由图2、图3知，各组浸提液·OH清除率和总抗氧化能力随浸泡时间的延长波动较大。结果表明,在蒜老化的过程中,通过酶促和化学反应自然产生了很多中间化合物,而这些化合物随着浸泡时间的延长不断进行转化最终形成老蒜提取物活性成分SAC和其它挥发性丙基硫化物,这些化合物对浸泡过程中抗氧化活性起到重要的影响,但目前机理尚未完全明确[19]。

图1 不同处理条件下老蒜提取物的DPPH·清除率Fig.1 DPPH· scavenging rate of AGE with different treatment conditions

图2 不同处理条件下老蒜提取物的·OH清除率Fig.2 ·OH scavenging rate of AGE with different treatment conditions

图3 不同处理条件下老蒜提取物的总抗氧化能力Fig.3 FRAP value of AGE with different treatment conditions

2.2.2 浸泡时间对老蒜提取物功能成分含量的影响 考察浸泡时间对老蒜提取物制备过程中功能成分含量的影响,测定结果如图4～图6。由图4可知,随着浸泡时间的延长,各组浸提液总糖含量呈先上升后下降的趋势,且经200 MPa处理后的样品在较多时间点高于其他组样品,且在55 d时达到较高值。由图5可知,随着浸泡时间的延长,200、300 MPa与未处理组浸提液SAC含量呈先上升后趋于平缓的趋势,而400 MPa条件下基本无明显上升趋势且含量较低,其中200 MPa条件下SAC含量上升最为明显,且在较多时间点高于其他组样品,并在55 d时达到较高值,这与文献报道中随着浸泡时间的延长,AGE中S-烯丙基半胱氨酸等水溶性有机化合物含量增加的结果一致[20]。由图6可知,随着浸泡时间的延长,各组浸提液SACS含量呈逐渐上升的趋势,且经400 MPa处理后的样品在较多时间点高于其他组样品,这可能是由于较高的压力使γ-谷氨酰转肽酶的酶活性降低,γ-谷氨酰半胱氨酸更多地通过氧化水解转化为SACS,而不利于转化为SAC[21]。综合考虑浸泡时间对老蒜提取物制备过程的影响,且由于商业老蒜提取物以SAC含量为指标,因此,确定200 MPa,浸泡时间55 d为处理条件。在该处理条件下,AGE产品中SAC含量为123.2 mg/L,换算为干重为1.9 g/kg,符合商业老蒜提取物中SAC含量为1.6～2.4 g/kg(干重)的标准[11]。

图4 不同处理条件下老蒜提取物的总糖含量Fig.4 Fructose content in AGE with different treatment conditions

图5 不同处理条件下老蒜提取物的 S-烯丙基半胱氨酸含量Fig.5 SAC content in AGE with different treatment conditions

图6 不同处理条件下老蒜提取物的 S-烯丙基半胱氨酸亚砜含量Fig.6 SACS content in AGE with different treatment conditions

3 结论

通过研究超高压处理条件对浸提液抗氧化活性及测定老蒜提取物制备过程中浸泡时间对浸提液性质的影响,确定超高压辅助制备老蒜提取物的最佳条件为：将新鲜大蒜去皮切片后,以料液比为1∶9 g·mL-1浸泡于10%的乙醇溶液中,于室温条件下进行超高压处理,处理条件为压力200 MPa,保压时间5 min,再于室温条件下避光保存55 d后制得老蒜提取物。该方法制得的AGE中SAC含量为1.9 g/kg(干重),符合商业老蒜提取物中SAC含量标准。因此,采用超高压辅助制备老蒜提取物,不仅极大地缩短了溶剂浸泡制得老蒜提取物备的工艺周期,而且为老蒜产品的研究与开发提供理论依据。

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