山杏内种皮磷脂类化合物提取工艺研究

纪丽丽,鲍宇宏,张晓旭,那 娜,于丹梅,韩 雪,刘伟强

(1.黑龙江林业职业技术学院,生态工程学院,黑龙江牡丹江 157000; 2.青岛黄海学院,护理与健康学院,山东青岛 266000)

磷脂是含磷酸基的类脂化合物,是组成生物膜的主要成分,是生命的基础物质之一,在生命过程中起结构形成作用和代谢作用。磷脂具有促进脂肪代谢、改善脂质代谢和调节膜酶活性等生理功能,是具有保健功能的食品添加剂。另外,磷脂具有乳化性,是工业中重要的表面活性剂和乳化剂[1]。磷脂主要是从动物脑组织、禽类蛋黄以及油料植物种子中提取[2]。常见磷脂提取方法有溶剂萃取法、超声波辅助萃取法、微波辅助萃取法、金属沉淀法、超临界CO2流体萃取法、膜分离法和酶催化法等,磷脂分析检测方法有薄层色谱分离法、柱色谱分离法、高效液相色谱法和核磁共振法等[3]。其中,微波辅助萃取法是基于微波场瞬时穿透性加热的原理而应用于有效成分提取的方法,该方法使目标组分在微波场作用下迅速生成大量的热能,加速目标组分由固体内部向固液界面扩散的速率[4]。微波辅助萃取技术具有溶剂用量少、操作时间短、提取率高等特点[5],广泛应用于多种天然产物的提取[6-7]。

山杏(Prunusmandshurica(Maxim.)Koehne)在北方地区分布广泛,是重要的经济林和造林树种,山杏的开发利用主要有山杏蛋白、山杏油、苦杏仁苷等[8]。种皮是杏仁加工时产生的下脚料,目前有以山杏种皮为材料提取黑色素[9]、总多酚[10]等化合物的研究,未见有提取磷脂的报道。本文利用微波辅助萃取法,研究山杏内种皮磷脂类化合物的提取工艺,并通过正交实验优化工艺参数,以高效液相色谱-紫外检测器法分离测定磷脂类化合物,为山杏的综合利用提供技术指导,提高产品的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山杏仁 购自牡丹江市农贸市场,经黑龙江林业职业技术学院张树宝教授鉴定;磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)标准品 Sigma公司;磷酸二氢钾、钼酸铵、抗坏血酸、无水醋酸钠、高氯酸 天津市凯通化学试剂有限公司;甲醇、乙腈、无水乙醇、正己烷 天津市大茂化学试剂厂;浓硝酸、氯仿 天津市津科精细化工研究所;液相色谱所用试剂 为色谱纯;其他试剂 为分析纯。

MCR-3微波化学反应器 上海丞伍仪器科技有限公司;LC-16高效液相色谱仪 日本岛津公司;SPD-16检测器 日本岛津公司;Milli-Q Academic超纯水仪 美国密理博公司;AR1140型电子天平 梅特勒-托利多公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-Ⅲ循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂;KQ-500DE型超声波清洗器 昆山舒美超声仪器有限公司;T6紫外-可见分光光度计 上海普析通用仪器有限公司;TGL16M型高速冷冻离心机 湖南凯达科学仪器有限公司;DGG-9023A电热恒温真空干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;HH-S-21-4数显恒温水浴锅 上海精科仪器有限公司;JP-500C粉碎机 永康市久品工贸有限公司;D8-XAB电热板 上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 磷显色液:钼酸铵1.25 g,无水醋酸钠4.10 g,蒸馏水溶解,定容至500 mL,与10%抗坏血酸水溶液按体积比9∶1混合;消化剂:高氯酸-硝酸体积比1∶4混合液。

1.2.2 磷标准曲线的建立 精密称取磷酸二氢钾0.0500 g,去离子水溶解,配制成标准磷溶液,此标准溶液中磷浓度为0.2275 mg/mL。分别吸取标准磷溶液5、10、20、30、40、50 μL,置具刻度试管中,加入0.25 mL消化剂,消化至液体无色,加入显色液定容至5 mL,65 ℃水浴显色10 min,紫外-可见分光光度计于820 nm处,测定吸光度[11]。以标准磷溶液的浓度为横坐标(X),以吸光度为纵坐标(Y),标准曲线方程为Y=0.1906X+0.0113,线性相关系数为0.9998,磷浓度在0.2275～2.275 μg/mL范围内,线性关系良好。

1.2.3 总磷脂得率测定 经过预实验,选择正己烷-乙醇(1∶2,mL/mL)为萃取试剂。准确称取山杏内种皮粉末1.000 g,置于溶样杯中,加入一定量的萃取试剂,在一定的萃取温度下,以一定的微波功率萃取一段时间。萃取结束后,6000 r/min离心10 min,上清液定容到25 mL。取5 mL于锥形瓶中,40 ℃水浴蒸干溶剂,另取一只锥形瓶为空白,分别加入10 mL消化液,低温加热,待黄烟冒尽后,升高温度,待溶液澄清时,停止加热。冷却至室温后,分别用显色液定容至5 mL,65 ℃水浴恒温10 min,冷却后以空白调零,于820 nm波长处测定吸光度,根据回归方程计算测定样品中磷的含量,再根据公式计算总磷脂得率[12-14]。

总磷脂得率(%)=X×V2×25/(V1×W×106)×100

式中:X为测定样品中磷元素质量(μg);V1为测定时吸取样品的体积(mL);V2为样品提取液的总体积(mL);W为样品的称样量(g);25为磷转换成磷脂的系数。

1.2.4 单因素实验 从萃取温度、萃取时间、微波功率、料液比四个方面进行单因素实验,考察其对总磷脂得率的影响[15-17]。

1.2.4.1 萃取温度对总磷脂得率的影响 料液比1∶20 (g/mL),微波功率300 W,微波时间15 min,考察萃取温度30、35、40、45、50、55 ℃对总磷脂得率的影响。

1.2.4.2 萃取时间对总磷脂得率的影响 料液比1∶20 (g/mL),微波功率300 W,微波温度45 ℃,考察萃取时间5、10、15、20、25、30 min对总磷脂得率的影响。

1.2.4.3 微波功率对总磷脂得率的影响 料液比1∶20 (g/mL),微波温度45 ℃,微波时间15 min,考察微波功率200、300、400、500、600、700 W对总磷脂得率的影响。

1.2.4.4 料液比对总磷脂得率的影响 微波功率300 W,微波温度45 ℃,微波时间15 min,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)对总磷脂得率的影响。

1.2.5 正交优化实验 在单因素实验的基础上,采用L9(34)表作正交实验,考察萃取温度、微波功率、萃取时间、料液比4个因素对磷脂得率的影响,确定微波辅助萃取山杏内种皮磷脂的最佳工艺条件[18]。正交实验因素与水平见表1。

表1 正交实验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.6 磷脂类化合物标准溶液的配制 精密称取磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)标准品,甲醇溶解并定容,得质量浓度为PC:1.6 mg/mL,PE:2.8 mg/mL,PG:1.6 mg/mL,LPC:2.0 mg/mL的标准品储备液[19]。

1.2.7 制备磷脂样品 称取样品1.000 g,正己烷-乙醇(1∶2,mL/mL)溶液25 mL,在微波温度45 ℃,微波功率400 W条件下提取15 min,萃取结束后,6000 r/min离心10 min,取上清液,0.75%氯化钠溶液萃取2次,收集有机相,旋转浓缩至近干,甲醇定容至10 mL,取样品溶液1 mL,甲醇稀释至10 mL,0.45 μm微孔滤膜过滤,得待测样品[20]。

1.2.8 色谱条件 色谱柱为ZORBAX Rx-SIL柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇∶乙腈=85∶15 (mL/mL);等度洗脱;流速1 mL/min;进样量20 μL;检测波长205 nm[21-23]。

1.3 数据处理

采用Microsoft excel 2016软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 微波萃取单因素实验

2.1.1 萃取温度对总磷脂得率的影响 萃取温度对总磷脂得率的影响见图1。由图1可知,温度升高,分子运动加速,磷脂类化合物的渗透、扩散、溶出速度加快,更易从细胞中转移到提取试剂中,在50 ℃时磷脂得率最大,为0.0873%,再升高温度时,由于磷脂类化合物对热不稳定,磷脂易发生分解,导致磷脂得率下降。

图1 萃取温度对总磷脂得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of phospholipids

2.1.2 萃取时间对总磷脂得率的影响 萃取时间对总磷脂得率的影响见图2。由图2可知,磷脂得率随萃取时间的延长而增加,当萃取时间为15 min时,磷脂得率有最大值,为0.0821%,再延长萃取时间,磷脂得率呈下降趋势。在较短时间内,微波对细胞结构破坏作用大,磷脂类化合物大量溶出,得率提高,而随着细胞破碎程度的加大,其他杂质的溶出也增加,且受高温影响,磷脂类化合物结构易发生改变,磷脂得率降低。

图2 萃取时间对总磷脂得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of phospholipids

2.1.3 微波功率对总磷脂得率的影响 微波功率对总磷脂得率的影响见图3。由图3可知,随着微波功率的增大,磷脂得率呈现先增后降的趋势,在400 W时磷脂得率达到最大值,为0.0899%。微波功率增大,微波能吸收增多,促进细胞破碎,磷脂类化合物溶出增加,但功率过大,可能破坏磷脂类化合物结构,导致磷脂降解,得率下降。

图3 微波功率对总磷脂得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on extraction yield of phospholipids

2.1.4 料液比对总磷脂得率的影响 料液比对总磷脂得率的影响见图4。由图4可知,料液比在1∶10～1∶25 (g/mL)时,磷脂得率升高明显,而料液比在1∶25～1∶35 (g/mL)时,磷脂得率增长趋于缓慢。增大萃取溶剂量,原料浸提充分,磷脂得率增加,而继续提高溶剂量,料液质量浓度差增幅逐渐降低,磷脂得率的增加也趋于平缓,从提取效果和降低成本方面考虑,料液比1∶25 (g/mL)最佳,此时磷脂得率为0.0886%。

图4 料液比对总磷脂得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of phospholipids

2.2 正交实验

设计正交实验对磷脂类化合物提取工艺进行优化,结果见表2。由表2可知,微波辅助萃取山杏内种皮磷脂类化合物的工艺中,各因素的影响主次顺序为:萃取时间(B)>微波功率(C)>料液比(D)>萃取温度(A),最佳工艺组合为A1B2C2D3,即料液比1∶25 (g/mL),萃取温度45 ℃,微波功率400 W,萃取时间15 min。在优化工艺条件下平行实验3次,验证工艺参数。山杏内种皮总磷脂得率为0.0977%±0.0015%,磷脂得率高且重复性好。

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal experiment results

对正交实验结果进行方差分析,结果见表3。由表3可知,萃取时间对磷脂类化合物提取有显著影响(p<0.05),微波功率、料液比和萃取温度均未显示出显著差异性(p>0.05)。

表3 方差分析结果Table 3 Analysis results of variance

2.3 磷脂类化合物标准品色谱图

分别吸取一定量的各磷脂标准品储备液,甲醇定容得混合标准溶液。按实验方法中色谱条件进行测定,4种磷脂类化合物标准品色谱图如图5所示。由图5可知,本文建立的方法各标准品出峰时间较快,峰形较好,基线稳定,分离度良好。PG、PE、PC及LPC标准品出峰时间分别为2.538、3.101、5.885 min及8.118 min。

图5 标准品色谱图Fig.5 Chromatograms of a mixed phospholipis standards注：1.PG;2.PE;3.PC;4.LPC。

2.4 标准曲线的绘制

分别取各磷脂标准品储备液,甲醇稀释,制成系列标准工作液,按实验方法中色谱条件进行测定。横坐标为标准品浓度,纵坐标为峰面积×106,进行线性回归。以信噪比S/N=3计算检出限。磷脂类化合物的线性方程、相关系数、测定范围及检出限见表4。由表4可知,各标准品标准曲线在测定范围内线性关系良好。在信噪比为3∶1时,测得PE、PC、PG及LPC标准品最低检测限分别为2.7、3.8、3.1 μg/mL及4.9 μg/mL。

表4 不同磷脂组分的线性方程Table 4 The linear regression equations of different phospholipids

2.5 精密度实验

重复6次测混合标准品溶液,磷脂化合物峰面积的RSD值分别为PC:1.45%,PE:1.27%,PG:1.33%,LPC:0.94%,仪器精密度良好。

2.6 样品测定

精密称取一定量的山杏内种皮样品,按样品制备方法进行处理,在实验方法中的色谱条件下测定,平行实验6次,样品色谱图如图6所示。由图6可知,山杏内种皮磷脂中有PE,而PC、PG与LPC未检测出。记录样品溶液PE的峰面积,取平均值,根据线性方程计算山杏内种皮PE含量为(0.3936±0.0082) mg/g。

图6 样品色谱图Fig.6 Chromatograms of sample

2.7 回收率实验

称取山杏内种皮样品1.000 g置于10 mL容量瓶中,分别加入一定体积的磷脂酰乙醇胺标准品储备液,处理样品,高效液相色谱测定含量,结果见表5。由表5可知,PE加样回收率在95.38%～98.56%之间,加样回收率和RSD数据表明,本实验方法对山杏内种皮中PE分析检测具有良好的准确度。

表5 加样回收率结果(n=6)Table 5 Spiked recoveries of different phospholipids(n=6)

3 结论

本文利用微波辅助萃取法提取山杏内种皮中磷脂类化合物,通过单因素实验和正交实验优化微波辅助萃取条件。最优条件为,微波温度45 ℃,萃取时间15 min,微波功率400 W,料液比1∶25 (g/mL),测得山杏内种皮总磷脂得率为0.0977%±0.0015%。高效液相色谱法测的磷脂酰乙醇胺(PE)含量为(0.3936±0.0082) mg/g。本研究对山杏资源的开发利用提供了一定的理论依据和数据支撑。

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