不同品种石榴果实挥发成分的SPME-GC-MS分析

金 婷,孙 欣,谭胜兵,李卓瓦,冯晓慧,王明林,*

(1.枣庄学院食品科学与制药工程学院,山东枣庄 277000; 2.山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安 271000)

石榴(PunicagranatumL.)又名安石榴、丹若、金罂,为石榴科(Punicacae)石榴属(PunicaL.)落叶灌木或小乔木[1],是一种深受人民喜爱的水果。山东枣庄是我国的石榴产区[2],栽培面积1 万hm2,年产石榴5万t,石榴品种达40种以上,所产石榴酸甜可口,除可生食外也可以加工成多种产品[3-6]。石榴本身属于低芳香性水果[7],因此对石榴挥发成分的测定相对较为困难。国内对其研究主要集中于石榴加工产品的研发和其各种有效成分如总酚物质的抗氧化活性[8-9]上,挥发成分研究略显不足[10]。随着石榴加工产品的增多,人们对其品质要求越来越高,而石榴果实中香气物质的种类和含量是构成及影响其风味品质的重要因素之一。国外研究则多集中于对石榴本身和其加工产品的香气成分研究上,如Melgarejo等[7]对9个石榴品种的挥发性成分进行了测定和感官鉴评,共检测出21种芳香成分。Beaulieu等[11]采用固相微萃取法从石榴中吸附香气成分并采用GC-MS进行测定。

固相微萃取技术是当前国内外广泛使用的一种富集挥发成分的方法。由于其灵敏度高、无溶剂、吸附性强,且能与气质分析技术进行联用等特点，已成为一种用于分析挥发成分的主流方法[12-15]。

本文以山东枣庄四种主产石榴为研究对象,采用固相微萃取进行样品香气成分的提取富集并优化萃取条件,确定不同品种石榴果实的香气成分,采用双向聚类分析进行分类与比较,为石榴果实特征香气研究及产品质量控制,提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大马牙、冰糖籽、大青皮甜、大红皮甜 山东枣庄驿城万亩石榴果园中最有代表性的四个石榴主产品种，随机选择成熟果实各10颗,冷藏4 ℃保存。

75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB三种型号固相微萃取头及萃取手柄、顶空进样瓶 美国Supelco公司;TQ8030三重四极杆气质联用仪 日本岛津公司;水浴锅 常州普天仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 将石榴果粒从果实中小心取出,保持石榴果实完整无损坏,选取大小均一的石榴颗粒5颗放入顶空瓶中密封,水浴加热至一定温度后,将固相微萃取头插入顶空瓶内石榴果粒上方,小心推出纤维头,萃取一定时间后,在进样口解析,待进样分析。

1.2.2 固相微萃取条件筛选 以色谱分离所得到的峰个数和峰面积为主要考察指标,对萃取条件进行确定。固定萃取条件为:萃取温度30 ℃、萃取时间30 min、解析3 min,考察不同规格萃取头(75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB)对萃取效果的影响。固定萃取条件为:65 μm PDMS/DVB型号萃取头、萃取温度30 ℃、萃取时间30 min,考察不同解析时间(1、2、3、4、5 min)对萃取效果的影响。固定萃取条件为:65 μm PDMS/DVB型号萃取头、萃取温度30 ℃、解析时间3 min,考察不同萃取时间(10、20、30、40、50、60 min)对萃取效果的影响。固定萃取条件为:65 μm PDMS/DVB萃取头、萃取时间30 min、解析时间3 min,考察不同萃取温度(20、30、40、50、60、70 ℃)对萃取效果的影响。

1.2.3 色谱条件 GC条件:色谱柱:Rtx-5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm);载气:氦气;进样口温度:250 ℃;程序升温:初始35 ℃;保持3 min;然后以12 ℃/min升温到60 ℃;再以5 ℃/min升温至230 ℃并保持5 min;色谱柱流量:1 mL/min;不分流进样。

MS条件:离子源:电子轰击离子源;离子源温度:230 ℃;接口温度:210 ℃;溶剂延迟时间:1 min;扫描方式:Q3 SCAN;扫描范围m/z:45～500;电离能量:70 eV;质谱库:NIST11、NIST11s。

1.2.4 分析方法 按1.2.2设置仪器参数,将吸附样品后的萃取头插入GC进样口,在进样口250 ℃ 解析平衡后Q3 SCAN扫描,再进行谱图解析并与质谱库比对,匹配后确定挥发成分,并采用峰面积法计算各挥发组分的相对含量。本文对四种石榴品种和它们的挥发成分采用离差平方和法进行聚类分析,分析采用PCOrdv5.0软件,相似性测定采用欧氏距离。

2 结果与分析

2.1 固相微萃取头的选择

从图1可以看出:萃取头65 μm PDMS/DVB相对于另外两种萃取头富集的挥发性物质数量及面积明显要更多,可能是因为65 μm PDMS/DVB萃取头既能吸附极性物质也能吸附非极性物质,因此吸附范围较大[16],在本文中选择使用65 μm PDMS/DVB固相微萃取头。

图1 不同萃取头对萃取效果的影响Fig.1 Influence of different extraction heads on extraction effect

2.2 解析时间的选择

从图2可以看出,随着解析时间的延长,出峰个数和峰面积先增大后减少,在解析时间为3 min时,石榴果粒中的挥发性物质的出峰个数和峰面积最大,说明在此时样品已经全部解析。此后峰面积和出峰个数均变小,可能是由于进样口温度高,从而使得挥发性物质发生分解,因此出峰个数和峰面积有所下降,故选择解析时间为3 min。

图2 解析时间对萃取效果的影响Fig.2 Influence of desorption time on extraction effect

2.3 萃取时间的选择

由图3可知,随着萃取时间的增加,挥发成分的出峰个数和出峰面积均在增加,30 min时均达到最大。30 min后,出峰个数开始逐步下降,峰面积有所反复但总体下降,这是由于在固相微萃取的过程中还存在着吸附-解析的平衡问题,因此,萃取时间过久反而不利于吸附,故选择萃取时间为30 min。

图3 萃取时间对萃取效果的影响Fig.3 Influence of time on extraction effect

2.4 萃取温度的选择

从图4可以看出,随着萃取温度的升高,出峰个数和总面积逐渐升高,这是由于高温有利于挥发性物质在基质中扩散,缩短了平衡时间,但另一方面,萃取头的吸附是放热过程,高温会使分配系数下降,致使样品吸附量下降[17],因此石榴果粒中的挥发性物质的出峰个数和峰面积稍有下降,故选择萃取温度为60℃。

图4 萃取温度对萃取效果的影响Fig.4 Influence of temperature on extraction effect

2.5 不同品种石榴果实挥发性物质成分分析

选用65 μm PDMS/DVB萃取头,在解析时间3 min,萃取温度60 ℃,萃取时间为30 min 的条件下对石榴果实的挥发性成分进行分离与鉴定。挥发成分见表1。

表1 石榴果实挥发性成分类别及相对含量Table 1 Aromatic compounds and their relative contents in the fruit of Punica granatum L.

续表

续表

由表1可知,在四种品种石榴中共确定出68种挥发性成分,主要包括28种烯类、13种酯类、13种醇类、6种醛类、2种酮类、1种酸类。其中大马牙中有41种挥发成分,冰糖籽48种,大青皮甜41种,大红皮甜39种。其中烯烃类物质在大马牙、冰糖籽和大青皮甜三个品种中的种类和含量均为最高,尤其是在冰糖籽和大青皮甜中所占比例达到67.3%和71.4%,是这几个品种石榴的主要香气构成体。其中主要的物质为β-蒎烯(清香)、对伞花烃(清香、柑橘香、香料香)、柠檬烯(柠檬味、柑橘味)、γ-萜品烯(脂香、木香)、石竹烯(辛香、木香、柑橘香)、反式-α-香柑油烯(花香),是构成石榴果香、清香味的主要成分。其次醇类物质在石榴的香气构成上也做出了较大贡献,尤其在大红皮甜中的含量为最高为21.4%,在另三个品种中的所占比重也仅次于烯烃类物质,其中主要包括己醇(椰子香)、月桂醇(紫罗兰香)等。另外酯类、酸类等成分也占有较大的比重。据文献报道[18],石榴品种的关键风味物质为β-蒎烯、对伞花烃、柠檬烯、己烯醇、石竹烯、cis-3-己烯醇等,与本文基本相符。

四个石榴品种共有的挥发成分共20种。共有成分在大马牙中占峰面积55.44%,冰糖籽中占54.39%,大青皮甜中占63.99%,大红皮甜中占45.99%。这些共有成分组成了石榴果实的共同特征香气，而其中相对含量较高的右旋柠檬烯、反式-α-香柑油烯、石竹烯、草酸环己基甲基十三酯、β-蒎烯和反-2-十四烯-1-醇为共有的关键香气成分。

2.6 石榴样品与其挥发物质的双向聚类分析

双向聚类分析是对矩阵的行与列同时进行聚类的一种数据挖掘技术,可以对聚类对象和聚类的属性同时聚类,相较传统聚类方法增加了一个计量维度[19]。

图5显示了石榴样品与石榴挥发成分两个维度的聚类结果。聚类图形的行聚类表示的是对石榴品种的聚类,列聚类表示的是石榴挥发成分的聚类。

应用欧氏距离,基于离差平方和法对数据进行聚类分析的结果如图5。对于石榴品种的行聚类,按一定的分组阈值,可以将4个石榴品种分成不同的组,在剩余信息为65%时可以将四个品种分为3类,冰糖籽与大青皮甜为一类;在剩余信息为50%时共分为两类,冰糖籽与大青皮甜为一类,大马牙与大红皮甜为一类。分类表明,从挥发成分上分析不同品种的石榴有各自品种的独特性及差异性[20]。

图5 4种石榴品种与68种挥发成分的双向聚类图Fig.5 Dendrogram of two-way cluster analysis of pomegranate varieties and 68 volatile component注:图左侧S1为大马牙;S2为冰糖籽;S3为大青皮甜;S4为大红皮甜。图右侧横坐标序号同表1。

对于挥发物的列聚类,在剩余信息为10%时将挥发成分分为四类,乙醛、左薄荷脑、甲氧基苯基肟和1-丁氧基-戊烯被分为一类,大红皮甜中的十八烯与含氧物质如醇、醛、酯和酮类物质等被分为一类,冰糖籽中的13种独立成分被分为一类,绝大多数的烯类与2-十四碳烯-1-醇、萜烯醇被分为一类。在剩余信息为5%时将上述四种分类合并成两类,前两种合为一类,后两种合为一类。

石榴果实在感官上以清香为主,其风味构成物质种类众多,主要包括醛类、酮类、醇类、烯烃类等。Antonio等[21]从石榴中检测到的挥发性风味成分以萜烯类为含量最高,包括月桂烯、壬醛、乙酸辛酯等,与本文研究基本相符。苑兆和等[10]在石榴果实中检测出42种香气成分,其中以醛类和醇类为主,与本文稍有出入,原因可能是果实生长环境的改变及品种差异造成的。

3 结论

本文采用HS-SPME结合GC-MS分析,对枣庄四种主产品种石榴进行了香气成分的鉴定,对其萃取条件进行优化,通过双向聚类分析对石榴品种及挥发成分进行分类。通过对固相微萃取条件筛选,确定选用65 μm PDMS/DVB萃取头,在萃取温度60 ℃,萃取时间30 min,解析时间3 min的条件进行下提取分离。在四种不同品种石榴中共分离鉴定出68种挥发成分,共有挥发成分20种，其中相对含量较高的右旋柠檬烯、反式-α-香柑油烯、石竹烯、草酸环己基甲基十三酯、β-蒎烯和反-2-十四烯-1-醇为共有的关键香气成分。每个品种也有各自特有的香气成分,大马牙、冰糖籽、大青皮及大红皮分别共有1种、13种、1种和7种独立香气成分,它们构成了不同品种各自独特的风味特点。双向聚类分析将4种石榴品种在剩余信息为65%时分为3类,挥发性成分在剩余信息为10%时将挥发成分分为四类。

对于不同品种石榴的挥发性物质进一步可采用人工感官鉴评与电子鼻等设备方法进行进一步的研究。

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