美味牛肝菌多糖对2型糖尿病大鼠肝损伤的改善作用

肖艳红,徐 倩,周晓慧,刘 楠,苟子薇,李素婷,*

(1.承德医学院生物化学教研室,河北承德 067000; 2.承德市中心医院,河北承德 067000)

2型糖尿病(T2DM)是由于胰岛素抵抗导致胰岛素信号传导通路受阻所引起的[1]。肝脏是人体代谢的中枢,长期的高血糖会造成肝脏氧化应激系统异常[2-4],出现肝损伤[5-7]。真菌多糖具有多种生理活性,如抗肿瘤、降血脂血糖、提高免疫力、抗氧化延缓衰老、抗菌、抗辐射等[8-11],从真菌中寻找和提取有活性的多糖一直是国内外食品与保健领域研究和开发的热点。

美味牛肝菌(Boletusedulis),归于牛肝菌属、美味牛肝菌种,又称大脚菇,是久负盛名的优质野生食用真菌,不但美味可口,营养丰富,还可药用,深受人们的青睐[12-13]。牛肝菌可分为美味牛肝菌、黑牛肝菌、褐环粘盖牛肝菌等[14],近来已有学者研究了几种牛肝菌提取成分的功效,郭永月[15]与王建明[16]分别研究了黑牛肝菌多糖与褐环粘盖牛肝菌的乙醇提取物对小鼠酒精性肝损伤及糖尿病有一定的改善,但未见美味牛肝菌多糖对T2DM大鼠肝损伤的保护作用的相关报道。

本研究采用高脂高糖饲料喂养联合STZ腹腔注射法构建T2DM大鼠模型[17],研究美味牛肝菌多糖的降糖、降脂以及糖尿病性肝损伤的保护作用,以期为美味牛肝菌多糖相关保健食品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

健康清洁级Wistar大鼠 40只,雄性,体重180～200 g,12周龄,由北京华阜康科技股份有限公司提供,动物合格证号为SCXK(京)2009-0008,饲养于承德医学院实验动物中心,自由摄食水,室温20～22 ℃,自然采光,通风良好;大鼠标准饲料及高脂高糖饲料 北京科澳协力饲料有限公司,其中高脂高糖饲料的配方为:猪油10%、蛋黄粉8%、胆固醇1.5%、蔗糖20%、胆酸钠0.1%、标准饲料60.4%;牛肝菌 承德润隆食品有限公司,批号20120906003,牛肝菌于恒温箱50 ℃烘干至恒重,并用植物粉碎机粉碎过80目筛制成粉末备用;牛肝菌多糖 由承德医学院生物化学教研室制备;链脲佐菌素(STZ) 美国Sigma公司,用时溶解于0.1 mol/L(pH=4.3)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,现用现配;盐酸二甲双胍 中美上海施贵宝制药有限公司,0.5 g/片,批号1311123;血糖仪及配套试纸 三诺生物传感股份有限公司,批号1312085;甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)检测试剂盒 南京建成生物工程公司,批号1708027;BCA蛋白浓度测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司,批号1705009;其他所用试剂 均为分析纯。

WSZ-133-65型电热恒温水浴锅 上海东星建材实验设备有限公司;旋转蒸发器 RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 石家庄阳星仪器贸易有限公司;LGJ-22D型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司;722可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;BFM-6A型植物粉碎机 济南倍力粉技术工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛肝菌多糖的提取 参照文献[18-20],准确称量牛肝菌粉末15.0 g,加300 mL石油醚于70 ℃水浴锅中脱脂1.5 h后抽滤。脱脂后的牛肝菌加水300 mL于100 ℃水浴锅中加热1.5 h,4000 r/min离心10 min。沉淀再次加水加热后4000 r/min离心10 min,两次上清液置于旋转蒸发仪进行浓缩,浓缩比为5∶1,向浓缩液中加入无水乙醇至醇浓度为80%。低温静置过夜后4000 r/min离心10 min,将上层酒精萃取液再次用旋转蒸发仪进行浓缩、80%醇沉、4000 r/min离心10 min,共重复三次。收集沉淀,即得牛肝菌多糖。-40 ℃低温冷冻48 h干燥,称量冻干膏,并计算多糖含量。采用苯酚-硫酸法[21]测定牛肝菌多糖提取物中多糖含量,以葡萄糖作标准曲线。回归方程为Y=11.732X,R2=0.996,说明线性关系良好。冻干膏中多糖含量(%)=多糖质量/冻干膏质量×100,经测定多糖含量为53.83%。

1.2.2 T2DM大鼠模型的建立及分组 取40只大鼠,随机分为正常组(A)、模型组(B)、牛肝菌多糖低剂量组(C)、牛肝菌多糖高剂量组(D)和二甲双胍阳性药物对照组(E),每组8只。标准饲料正常饲养1 w后,B、C、D、E组给予高脂高糖饲料进行造模,为期28 d,第29 d禁食12 h,一次性腹腔注射35 mg/kg·bw STZ;A组继续给予标准饲料后注射同等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后经内眦眼眶后静脉丛采血,测空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。各组分笼饲养,A、B组给予生理盐水灌胃,C、D组给予牛肝菌多糖(200、400 mg/kg·bw),E组给予二甲双胍(200 mg/kg·bw),1次/d,连续给药4 w。

1.2.3 指标的测定 给药前、末次给药后两次各组大鼠内眦眼眶后静脉丛采血,使用血糖仪配备试纸测定各组大鼠空腹血糖(GLU);给药结束后麻醉大鼠,腹主动脉取血,血样4 ℃静置2 h,3000 r/min离心10 min后取上清,根据试剂盒说明书测定各组大鼠血清中TG、ALT与AST;处死大鼠后称量体重及肝脏湿重,参照文献[22],计算各组大鼠肝脏指数,肝脏指数=(肝脏重量/体重)×1000;取肝脏,利用生理盐水制备10%肝匀浆,3000 r/min离心10 min后取上清,测定CAT、SOD、GSH-Px、GSH、MDA,具体操作步骤参照各种试剂盒说明书进行。

1.3 数据处理

结果采用SPSS 19. 0统计软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用q检验。以p<0.05表示差异具有统计学意义,p<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 美味牛肝菌多糖对2型糖尿病大鼠血糖含量的影响

由表1可知,给药前4个造模组大鼠血糖含量均高于16.7 mmol/L,并显著高于正常组(p<0.01),说明造模成功。与给药前比较,给药4 w后,牛肝菌多糖低、高剂量组大鼠与二甲双胍组大鼠血糖含量均显著降低(p<0.01),并均显著低于模型组(p<0.05),且牛肝菌多糖高剂量组与阳性药物二甲双胍组大鼠血糖含量无显著性差异(p>0.05)。以上结果表明,美味牛肝菌多糖能够降低T2DM大鼠血糖含量,高剂量组降糖效果与二甲双胍相近。

表1 美味牛肝菌多糖对大鼠血糖含量的影响Table 1 Effects of Boletus edulis polysaccharides on blood glucose contents of

2.2 美味牛肝菌多糖对2型糖尿病大鼠体重与肝脏指数的影响

如表2所示,与正常组比较,模型组大鼠的体重显著减轻(p<0.01),并显著低于3组药物组(p<0.01);肝脏指数显著升高(p<0.01),并显著高于3组药物组(p<0.01),且牛肝菌多糖高剂量组与二甲双胍组大鼠的体重与肝脏指数均无显著性差异(p>0.05)。以上结果表明,美味牛肝菌多糖能改善糖尿病“三多一少”中体重减轻的症状,并有效降低肝脏指数,减轻脂肪在肝脏的堆积。高剂量组与二甲双胍组作用效果相当。

表2 美味牛肝菌多糖对大鼠体重及肝脏指数的影响Table 2 Effects of Boletus edulis polysaccharides on body weight and liver index of

2.3 美味牛肝菌多糖对2型糖尿病大鼠血清TG含量与ALT、AST活力的影响

由表3可知,与正常组比较,模型组大鼠血清中TG含量与ALT、AST的活力均显著升高(p<0.01),并显著高于3组药物组(p<0.01),且牛肝菌多糖高剂量组与二甲双胍组大鼠的各项结果均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明,美味牛肝菌多糖能减少T2DM大鼠血脂含量,减轻肝脏细胞损伤,降低血清中肝内酶的活力,高剂量组与二甲双胍组功效相近。

表3 美味牛肝菌多糖对大鼠血清TG含量与ALT、AST活力的影响Table 3 Effects of Boletus edulis polysaccharides on TG contents and activities of ALT and ASTin serum of

2.4 美味牛肝菌多糖对2型糖尿病大鼠肝脏CAT、SOD与GSH-Px活力的影响

由表4可知,与正常组比较,模型组大鼠肝脏中CAT、SOD和GSH-Px活力均显著降低(p<0.01);与模型组相比,3组药物组大鼠肝脏中CAT、SOD 和 GSH-Px活力均显著升高(p<0.01)。其中,牛肝菌多糖高剂量组大鼠肝脏中CAT、SOD和GSH-Px活力显著高于二甲双胍处理组大鼠(p<0.01)。以上结果表明3组药物能够改善T2DM大鼠肝脏组织中CAT、SOD等抗氧化酶活力。

表4 美味牛肝菌多糖对大鼠肝脏CAT、SOD与GSH-Px活力的影响Table 4 Effects of Boletus edulis polysaccharides on activities of CAT,SOD and GSH-Px in liver of protein)

2.5 美味牛肝菌多糖对2型糖尿病大鼠肝脏GSH与MDA含量的影响

如表5所示,与正常组比较,模型组大鼠肝脏组织中GSH含量明显降低,但MDA的含量显著升高(p<0.01);与模型组相比,3组药物组大鼠肝脏组织中GSH含量显著升高,而MDA含量显著降低(p<0.01)。其中,牛肝菌多糖高剂量组大鼠肝脏组织中GSH含量显著高于二甲双胍组大鼠,MDA的含量显著低于二甲双胍组大鼠(p<0.01)。以上结果表明,3组药物能够提高T2DM大鼠肝脏中抗氧化物质GSH的水平,降低过氧化产物MDA的含量,美味牛肝菌多糖高剂量组的效果优于二甲双胍。

表5 美味牛肝菌多糖对大鼠肝脏 GSH与MDA含量的影响Table 5 Effects of Boletus edulis polysaccharides on GSH and MDA contents in liver of

3 讨论

本研究通过建立T2DM大鼠模型,探讨美味牛肝菌多糖对T2DM大鼠肝脏的保护作用。结果表明,与模型组相比,美味牛肝菌多糖处理组大鼠的GLU(p<0.05)和TG(p<0.01)含量均显著降低,表明美味牛肝菌多糖具有较好的降血糖降血脂作用[23];肝脏指数明显降低,表明美味牛肝菌多糖能够促进糖脂代谢[24],减少脂肪在肝脏的堆积[25-26];肝脏抗氧化酶系CAT、SOD、GSH-Px的活力和非酶抗氧化物质GSH的含量显著升高(p<0.01),且脂质过氧化产物MDA的含量显著降低(p<0.01),进一步表明美味牛肝菌多糖可以通过恢复肝脏氧化应激系统功能[27-28],提高肝脏抗氧化能力,抵御过氧化物的攻击,清除各种自由基,减轻肝脏细胞膜脂质过氧化的程度[29];ALT、AST是存在于肝细胞内的代谢酶类,血清中ALT、AST的活力可直接作为肝功检测的指标[30],美味牛肝菌多糖组大鼠血清ALT、AST的活力显著降低充分说明美味牛肝菌多糖可以保护肝脏组织,减轻肝细胞炎症、坏死等损伤,维持肝细胞膜结构的完整性[31]。美味牛肝菌多糖高剂量组大鼠肝脏组织中CAT、SOD、GSH-Px的活力与GSH的含量均显著高于阳性药物二甲双胍组大鼠,且MDA的含量显著低于二甲双胍组大鼠,说明美味牛肝菌多糖对减轻T2DM大鼠的肝损伤有显著的功效,且有一定的剂量依赖性。以往研究大多为关于美味牛肝菌多糖提取方法的优化,体外检测抗氧化能力等,未见有关美味牛肝菌多糖对大鼠糖尿病性肝损伤影响的报道。本研究表明，美味牛肝菌多糖能够改善T2DM大鼠的肝损伤,可为将美味牛肝菌多糖开发为预防治疗T2DM的保健品提供新的思路。但究竟美味牛肝菌多糖中何种组分实现其降糖功能,以及影响糖代谢途径中哪些基因的表达等问题,有待深入的探讨。

4 结论

美味牛肝菌多糖通过降糖、降脂,提高T2DM大鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px活力和GSH的含量,抵抗自由基及各种过氧化物的攻击,降低了血清ALT、AST活力与肝脏MDA的含量,对T2DM大鼠的肝损伤有极大的保护作用,但其具体机制还需进一步研究。

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