瓜蒌蒸制前后还原糖及总糖的比较研究

鄢海燕，宗倩妮，邹纯才，张 娜

（皖南医学院药学院，安徽芜湖 241002）

瓜蒌为葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）或双边栝楼（Trichosanthes rosthorniiHarms）的干燥成熟果实（阴干），有清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠之功效，具焦糖气，味微酸、甜〔1〕。由于瓜蒌阴干时间较长且易破碎，现多采用将瓜蒌进行蒸制后压片切条的方法进行炮制，该方法不仅可以杀死瓜蒌中的微生物且易于保存〔2-3〕。对于瓜蒌，传统经验以“糖味浓者为佳”〔4〕，说明糖分含量的高低对瓜蒌的质量具有评判价值。为考察瓜蒌蒸制前后还原糖及总糖的变化，本实验以D-无水葡萄糖为对照品，采用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）显色法及苯酚-硫酸显色法分别测定瓜蒌蒸制前后还原糖和总糖的含量，以期为瓜蒌的炮制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 FA2004型电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）；UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；6202型高速粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司）。

1.2 药品与试剂

1.2.1 药品 瓜蒌（河北安国市御颜坊中药材有限公司，批号：20150830、20151201、20160801、20161102、20161201），经皖南医学院生药学教研室包淑云副教授鉴定为葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）的成熟果实。

1.2.2 试剂 石油醚（天津市福晨化学试剂厂，批号：20150708）；苯酚（无锡市展望化工试剂有限公司，批号：20110320）；浓硫酸（南京化学试剂有限公司，批号：4061350322）；3，5-二硝基水杨酸（山东西亚化学工业有限公司，批号：T90937）；D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，含量≥99.9%，批号：110833-201504）；蒸馏水（自制）。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 瓜蒌蒸制品 将瓜蒌置于蒸笼内，以30 mL∕min的蒸气量蒸40 min后，40℃干燥24 h，备用。

2.1.2 瓜蒌及瓜蒌蒸制品溶液 取过40目筛的瓜蒌及瓜蒌蒸制品细粉0.2 g，精密称定，加20 mL石油醚水浴回流30 min，过滤并挥干石油醚〔4〕，向滤渣中加水20 mL，水浴2 h，过滤，水洗滤渣3次，合并滤液于50 mL容量瓶中，定容成4 mg∕mL（相当于原药材），备用。

2.1.3 还原糖和总糖供试品溶液 精密吸取1 mL瓜蒌及瓜蒌蒸制品溶液，作为测定还原糖的供试品溶液；精密吸取还原糖供试品溶液1 mL置25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作为测定总糖的供试品溶液，备用。

2.2D-无水葡萄糖对照品溶液 精密称取D-无水葡萄糖对照品5 mg，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.5 mg∕mL的D-无水葡萄糖对照品溶液，备用。

2.3 显色试剂的配制

2.3.1 DNS试剂 取DNS0.60 g，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，加2 mol∕L氢氧化钠溶液32.5 mL和丙三醇4.5 g，加水定容至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 5%苯酚溶液 取苯酚5.00 g，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得。

2.4 统计学方法 实验数据以均数±标准差（xˉ±s）表示，用SPSS 11.5软件进行统计学处理。两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.5 测定波长的选择 分别精密量取D-无水葡萄糖对照品溶液、还原糖和总糖供试品溶液，按还原糖和总糖标准曲线的建立方法处理，用紫外-可见分光光度计于200～800 nm波长范围扫描吸收光谱。参照文献〔4〕为消除DNS本身紫外可见吸收对样品测定的影响，选择供试品显色液-水（水为参照）和供试品显色液-DNS试剂（DNS试剂为参照）曲线重合的540 nm作为还原糖的测定波长，见图1，选择487 nm作为总糖的测定波长，见图2。

2.6 标准曲线的绘制

2.6.1 还原糖标准曲线 精密吸取D-无水葡萄糖对照品溶液（0.5 mg∕mL）0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mL于5 mL具塞刻度试管中，加DNS试剂1.5 mL，加水至3.5 mL，水浴7 min，取出放至室温，补充水至3.5 mL〔5〕。采用紫外-可见分光光度法于540 nm处测定吸光度值，以D-无水葡萄糖质量（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行回归分析，回归方程为y=6.895 8x-0.146 7，r=0.999 1。结果表明D-无水葡萄糖在0.04～0.20 mg范围内有良好的线性关系。

图1 瓜蒌还原糖供试品与对照品的光谱图

图2 瓜蒌总糖供试品与对照品的光谱图

2.6.2 总糖标准曲线 精密吸取D-无水葡萄糖对照品溶液（0.5 mg∕mL）0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mL，以蒸馏水为溶剂，分别定容至2 mL，再加入5%的苯酚溶液1 mL，摇匀后迅速加入浓硫酸5 mL，放置10 min后沸水浴20 min，取出后以流水冷却至室温〔6〕。采用紫外-可见分光光度法于487 nm处测定吸光度。以葡萄糖质量（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行回归分析，回归方程为y=14.879 4x+0.0337，r=0.9995。结果表明D-无水葡萄糖在0.005～0.080 mg范围内有良好的线性关系。

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度试验 精密吸取瓜蒌（批号：20151201）蒸制品还原糖及总糖供试品溶液各1 mL，照“2.6”项下操作，连续测定5次，记录吸光度值，计算还原糖和总糖的浓度，结果RSD值分别为0.76%和0.054%，表明精密度良好。

2.7.2 重复性试验 取同一批瓜蒌（批号：20151201）蒸制品，按“2.1.2”项下方法平行制备5份供试品溶液。按“2.6.1”及“2.6.2”项下方法显色测定吸光度值，计算还原糖和总糖的浓度，结果RSD值分别为1.23%和0.68%，表明重复性良好。

2.7.3 稳定性试验 精密吸取瓜蒌（批号：20151201）蒸制品还原糖及总糖供试品溶液各1份，照“2.6.1”及“2.6.2”项下方法显色，分别于第 0、10、20、30、60、90 min测定吸光度，计算还原糖和总糖的浓度，结果RSD值分别为1.58%和0.93%，表明样品显色后90 min内稳定。

2.7.4 加样回收率试验 精确量取已知含量的瓜蒌（批号：20151201）蒸制品还原糖供试品溶液9份，分为3组，每组3份，每份0.2 mL置于5 mL具塞刻度试管中，每组分别按还原糖已知含量的80%、100%、120%精密加入D-无水葡萄糖对照品。照“2.6.1”项下操作进行还原糖回收率试验；精确吸取已知含量的瓜蒌（批号：20151201）蒸制品总糖供试品溶液9份，分为3组，每组3份，每份1 mL于具塞试管中，每组分别按总糖已知含量的80%、100%、120%精密加入D-无水葡萄糖对照品，照“2.6.2”项下操作进行总糖的回收率试验。见表1。

表1 还原糖和总糖加样回收率试验结果

2.8 样品的测定

2.8.1 还原糖的含量测定 分别取蒸制前后瓜蒌各5份，按“2.1.2”“2.1.3”项下制备还原糖供试品溶液。取瓜蒌还原糖供试品溶液0.5 mL、瓜蒌蒸制品还原糖供试品溶液0.3 mL，照“2.6.1”项下操作，测定吸光度值，计算瓜蒌及其蒸制品中还原糖的含量。见表2。

2.8.2 总糖的含量测定 分别取蒸制前后瓜蒌各5份，按“2.1.2”“2.1.3”项下制备总糖供试品溶液。取瓜蒌总糖供试品溶液2 mL、瓜蒌蒸制品总糖供试品溶液1 mL，照“2.6.2”项下操作，测定吸光度值，计算瓜蒌及其蒸制品中总糖的含量。见表2。

表2 瓜蒌及其蒸制品还原糖及总糖的含量测定结果（ˉ± s，n=5）

表2 瓜蒌及其蒸制品还原糖及总糖的含量测定结果（ˉ± s，n=5）

注：与瓜蒌比，*P＜0.01。

样品瓜蒌瓜蒌蒸制品还原糖∕%5.54±0.11 8.07±0.31*总糖∕%6.71±1.05 11.51±0.32*

由表2可知，瓜蒌蒸制后，还原糖和总糖含量均升高，且与瓜蒌相比差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

还原糖本身有还原性，转化糖可经多种途径转化成还原糖，其他碳水化合物如淀粉、蔗糖等水解也生成还原糖。还原糖可反映植物体内碳水化合物运转情况，在有机体的代谢中起着重要作用，还能形成其他物质如有机酸等。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖等和在测定条件下能水解为还原性的单糖如蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。瓜蒌多糖是瓜蒌的重要组成部分〔7〕，在抗氧化、抗肿瘤、降血糖、免疫调节等方面具有药理活性〔8〕。且多糖类化合物通常没有细胞毒性，不影响正常细胞功能，具有高效低毒的特点〔9〕。因此，含糖量的多少是瓜蒌品质的重要评价指标，自古就有以“糖味浓者为佳”的传统经验。

本实验采用DNS和苯酚-硫酸法测定了瓜蒌及其蒸制品的还原糖和总糖含量，发现与瓜蒌相比，瓜蒌蒸制后还原糖和总糖的含量均升高且差异有统计学意义（P＜0.01），在蒸制的过程中也可闻到“焦糖香味”。瓜蒌蒸制前后还原糖和总糖的含量变化源自于蒸制时的高温水解。该实验为采用蒸制方法对瓜蒌进行炮制提供了科学依据。前期实验探讨了蒸气量和蒸制时间对瓜蒌中专属性成分3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的影响，发现蒸气量超过30 mL∕min，蒸制时间超过40 min会影响3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的含量。为此，本实验采用蒸气量30 mL∕min，蒸制时间40 min对瓜蒌进行炮制。有关蒸气量和蒸制时间对瓜蒌中还原糖和总糖含量变化的影响，特别是对药效学的影响还有待深入的研究。

〔1〕国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部〔M〕.北京：中国医药科技出版社，2015：112.

〔2〕巢志茂，何波.瓜蒌的产地烘蒸加工〔J〕.中药材，1999，22（4）：185-186.

〔3〕宗倩妮，王静，徐启祥，等.瓜蒌及其炮制品红外光谱分析〔J〕.大理大学学报，2017，2（2）：24-30.

〔4〕孙文，巢志茂，王淳，等.瓜蒌饮片中总糖及还原糖的含量测定〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013，19（9）：96-99.

〔5〕张志君，孙伟，李永亮，等.3，5-二硝基水杨酸法联合苯酚-浓硫酸法测定不同产地黄精中多糖含量〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：106-109.

〔6〕张璐，翁立冬，刘莉，等.苯酚-硫酸法测定乌梅多糖的含量〔J〕.中国实验方剂学杂志，2011，17（6）：107-109.

〔7〕万丽娟，卢金清，许俊洁，等.瓜蒌子化学成分和药理作用的研究进展〔J〕.中国药房，2015，26（31）：4440-4443.

〔8〕王新新.瓜蒌多糖的提取、纯化及其抗氧化、斑马鱼心脏保护活性研究〔D〕.泰安：山东农业大学，2016.

〔9〕王新新，王晓，任鸿远，等.超高压提取瓜蒌多糖体外抗氧化活性研究〔J〕.食品科技，2016，41（1）：170-175.