分子印迹固相萃取-高效液相色谱法同时检测烟叶中磺酰脲类农药残留

郑亚丽,　顾丽莉*,　师君丽,　张梦晓,　孔光辉,李志君,　韩　毅,　彭　健

(1. 昆明理工大学化学工程学院, 云南 昆明 650500; 2. 云南省烟草农业科学研究院, 云南 玉溪 653100)

烟草种植过程中使用农药以提高其产量和质量,其中磺酰脲类除草剂因高效、广谱、低毒等特点,已经成为当今世界使用最广泛的除草剂之一[1-3]。但是该类除草剂会长久地残留在农作物及其种植的土壤中。研究表明,吸食含有农药残留烟叶制成的烟丝,会严重危害主动和被动吸食者的健康[4,5]。因此,各类农药残留的精准检测数据为烟草监管和控制提供了重要依据。

为了确保大豆、稻谷等农作物中的磺酰脲类农药残留含量在食品安全允许范围内[6,7],国内外研究者主要借助液相色谱及其联用技术对其在生产过程中的含量进行检测[8-10]。现阶段该方法在磺酰脲类农药残留检测中遇到的主要问题是:预处理步骤繁琐,基质干扰严重,检测效率受限[11-15]。故而,探索农作物及土壤中磺酰脲类农药残留的预处理方法具有重要的意义。同时,国内外食品安全机构往往会对多品种和类型的农药残留进行检测,因此单残留的检测方法已经不能满足实际需要。分子印迹聚合物具有选择性高、稳定性好、物理化学性质稳定等优点,作为固相萃取材料,可从复杂基质中分离富集目标分子及其结构相似物,降低基质的干扰,作为前处理手段,能提高分析精度和准确性[16-19]。因此本文利用分子印迹固相萃取法(MISPE)建立了同时检测烟叶中氯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆和烟嘧磺隆等6种磺酰脲类除草剂残留的分析方法。实验结果表明,该方法简便、快速,净化效果好,可以应用于实际烟叶样品中磺酰脲类除草剂的检测。

1　实验部分

1.1　仪器、试剂与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器(DAD))和Agilent Vac Elut 20固相萃取仪(安捷伦有限公司); VEGA 3 SBH扫描电子显微镜(SEM,泰斯肯贸易(上海)有限责任公司); Equinox55傅里叶红外光谱仪(FT-IR,德国BRUKER); STA449F3热重分析仪(德国耐驰); UV-1800PC紫外分光光度计(上海美普达仪器有限公司); Millipore Milli-Q Reference美国超纯水仪(德国默克); RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); Sartorius pp-25 pH计(德国赛多利斯); ZD-85气浴恒温振荡器(金坛市城东新瑞仪器厂); Scilogex MX-S涡旋仪(北京科博赛尔科技有限公司); HK-1D恒温水槽(南京南大万和科技有限公司); BSA2245-CW电子天平(德国赛多利斯公司); KQ22000B超声波清洗器(宁波海曙金达超声波设备有限公司)。

氯磺隆(CS,纯度99.0%)、甲磺隆(MSM,纯度99.5%)、苄嘧磺隆(BSM,纯度98%)、苯磺隆(TBM,纯度99.5%)、胺苯磺隆(EMS,纯度99.0%)、烟嘧磺隆(NS,纯度99.0%)和异丙隆(IS,纯度99.0%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;甲基丙烯酸(MAA)和偶氮二异丁腈(AIBN)购自天津市光复精细化工研究所,使用前已提纯;三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)购自阿拉丁;二氯甲烷(DCM)、乙腈、无水甲醇、冰乙酸、丙酮、磷酸、正己烷均为国产分析纯。

烟叶样品为市售。

1.2　分子印迹聚合物微球的合成及SPE柱的制备

将0.2 mmol CS、0.8 mmol MAA和60 mL DCM放入100 mL硼硅酸玻璃瓶中,混合后于25 ℃恒温振荡预聚合4 h,再加入0.8 mmol TRIM和30 mg AIBN,继续振荡2 h。通氮气10 min后密封玻璃瓶,于60 ℃恒温反应24 h。将反应聚合物倒入培养皿干燥后进行索氏提取,用甲醇-乙酸(9∶1, v/v)重复洗脱该聚合物,直至上清液中检测不到CS为止,再用甲醇洗涤残留在聚合物上的乙酸至中性,最后用丙酮洗去杂物,将洗涤后的聚合物于50 ℃真空干燥至恒重,即得CS-MIP(chlorsulfuron molecularly imprinted polymers)。非分子印迹聚合物(NIP, non-molecularly imprinted polymers)的制备除了不加模板分子(CS)外,所有步骤同上。采用SEM及FT-IR对聚合物的形貌及结构进行表征。

将100 mg CS-MIP和100 mg NIP分别装入3 mL的空柱中,压实并用0.45 μm滤膜支撑和限制填充物,制得MIP-SPE和NIP-SPE柱,待用。

1.3　标准溶液的配制

称取CS、MSM、BSM、TBM、EMS、NS和IS标准物质各20 mg分别置于100 mL容量瓶中,加入乙腈溶解后定容至刻度,即配制成200 mg/L的7种标准储备溶液,置于4 ℃的冰箱中待用,使用时用乙腈稀释成适当浓度的标准工作液。

1.4　样品制备

将烟叶粉碎,准确称取烟叶粉末2.00 g置于20 mL离心管中,加入10 mL二氯甲烷,涡旋振荡3 min后超声30 min,再高速离心10 min,过滤上清液并旋转蒸发至干,将所得干燥样品用1 mL乙腈溶解。

1.5　HPLC检测条件

Agilent SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm,美国Agilent公司);柱温:30 ℃;进样量:10 μL;流速:0.8 mL/min;检测波长:241 nm。流动相A:乙腈-水(20∶80, v/v, 磷酸调pH为3);流动相B:乙腈-水(80∶20, v/v, 磷酸调pH为3);梯度洗脱:0 min(40%B)→8 min(40%B)→12 min(60%B)→17 min(70%B)→20 min(100%B)→22 min(100%B)→23 min(40%B)→28 min(40%B)。

1.6　聚合物微球的吸附特性

1.6.1动态吸附

准确称取若干份等量的CS-MIP和NIP于20 mL离心管中,每份20 mg,各加入5 mL质量浓度为5 mg/L的CS标准溶液,于室温下恒温振荡进行吸附。按不同振荡时间取出离心管,经离心和过滤收集上清液,将上清液旋转蒸发至干,所得干燥物用1 mL乙腈定容,并用1.5节方法定量检测。由方程(1)计算分子印迹聚合物对模板分子的吸附量,重复3次取平均值。

(1)

式中Qi为单位质量聚合物对目标分子i的吸附量(mg/g);C0,Ct分别为吸附初始和终止时目标分子在溶液中的质量浓度(mg/L);V为标准溶液体积(L);m为CS-MIP或NIP的质量(g)。

1.6.2选择性吸附

本实验选择了模板分子(CS)、与CS结构相似的磺酰脲类(MSM、BSM)和非磺酰脲类(IS)除草剂为目标分离物,分别测定CS-MIP与NIP对它们的饱和吸附量。准确称取若干份等量的CS-MIP和NIP于20 mL离心管中,每份20 mg,各加入5 mL质量浓度为5 mg/L的上述目标分离物的标准溶液,室温下恒温连续振荡18 h,达到吸附平衡后,取出离心管,经离心和过滤收集上清液,旋转蒸发至干,乙腈复溶,用1.5节方法检测目标分离物的浓度,由方程(1)计算聚合物对目标分子的饱和吸附量,实验重复3次取平均值。

1.7　MIP-SPE条件

先用5 mL乙腈-二氯甲烷(1∶1, v/v)对MIP-SPE柱进行预活化,之后取0.5 mL CS标准溶液上样,上样溶剂为乙腈。然后用2 mL 正己烷淋洗小柱以除去非特异性干扰物,最后用5 mL甲醇-乙酸(9∶1, v/v)进行洗脱,收集洗脱液,旋转蒸发至干,然后用1 mL乙腈定容,待测。

图 1 　氯磺隆分子印迹聚合物的扫描电镜图Fig. 1 　Scanning electron microscopy (SEM) image of the prepared chlorsulfuron-molecularly imprinted polymers (CS-MIP)

2　结果与讨论

2.1　分子印迹聚合物的表征

所制备的CS-MIP扫描电镜形貌见图1。从图1可以看出,以二氯甲烷为致孔剂和聚合溶剂,在密闭反应装置中沉淀聚合可得到分散性良好、颗粒均匀的聚合物微球。

图2为CS-MIP及NIP的红外光谱扫描结果;氯磺隆的红外光谱图参考Guo等[20]的文献。从MIP洗脱前后及NIP的红外光谱图可看出,MIP洗脱前有4个明显的特征吸收峰,3 245 cm-1处出现了-NH的伸缩振动,1 566 cm-1处出现了仲酰胺-NH的弯曲振动、1 364 cm-1处出现了磺酰胺-R-SO2-NH2-的极强吸收峰,759 cm-1处检测到了C-H的弯曲振动,这4个吸收峰都是CS的红外特征吸收峰,说明洗脱前的MIP中含有CS,而NIP与洗脱后的MIP中没有CS。由此可知,模板分子CS被印迹在了MIP中,并且能够被适当溶剂洗脱下来。

图 2 　氯磺隆分子印迹聚合物与非分子印迹聚合物的红外光谱图Fig. 2 　Infrared spectra of the CS-MIP and non- molecularly imprinted polymers (NIP)　a. MIP before soxhlet extraction; b. MIP after soxhlet extraction; c. NIP.

2.2　聚合物的吸附特性

2.2.1动态吸附曲线

图3为CS-MIP微球对CS的吸附量与时间的关系曲线。由图3可知,CS-MIP的吸附量均大于NIP的,推测与分子印迹特定位点的吸附效应有关。从吸附开始至3 h,吸附量增加较为显著,3 h之后,吸附量增加缓慢且趋于稳定。

图 3 　CS-MIP与NIP对CS的动态吸附曲线(n=3)Fig. 3 　Dynamic adsorption curves of the CS-MIP and NIP for CS (n=3)

图 4 　CS-MIP与NIP对不同农药的选择性吸附(n=3)Fig. 4 　Selective adsorption of the CS-MIP and NIP for different herbicides (n=3)　CS: chlorsulfuron; MSM: metsulfuron-methyl; BSM: bensulfuron-methyl; IS: isoproturon.

2.2.2选择性吸附

CS-MIP和NIP对CS、MSM、BSM和IS的饱和吸附结果见图4。CS-MIP对CS的吸附量是NIP的2.16倍,且明显高于其他3种除草剂,说明CS-MIP对CS具有一定的选择吸附特性。此外,CS-MIP对3种磺酰脲类除草剂(CS、MSM、BSM)的吸附量明显大于NIP,而对非磺酰脲类除草剂(IS)的吸附量与NIP相当,说明CS-MIP对磺酰脲类除草剂具有特异吸附效应。

2.3　MIP-SPE条件的选择

以模板分子CS为目标分离物,考察了乙腈和二氯甲烷作为上样溶剂对分析的影响。结果表明,采用二氯甲烷时,HPLC检测中会出现溶剂峰干扰,而采用乙腈时则不会,故选择乙腈为上样溶剂。

在收集样品中模板分子或结构相似物前,需要用弱极性淋洗剂溶解去除MIP-SPE柱中与其作用力较弱的杂质,同时尽量不溶出目标分离物。实验以模板分子CS为目标分离物,考察了不同淋洗剂(正己烷、水、二氯甲烷、甲醇-水(1∶8, v/v)、甲醇-水(1∶6, v/v)以及甲醇-水(1∶4, v/v)(所用水的pH均用磷酸调为3))对氯磺隆回收率的影响,结果见图5。结果表明,用2 mL正己烷作淋洗剂可减少烟叶中非特异性吸附的干扰,且对氯磺隆的回收率最高。因此,本实验选择正己烷为淋洗溶剂。

图 5 　不同淋洗剂下氯磺隆的回收率Fig. 5 　Recoveries of CS with different washing solvents

2.4　SPE柱净化效果的比较

图6是含6种除草剂的烟叶样品经NIP-SPE柱或MIP-SPE柱净化后得到的色谱图,可以看出,图6a存在较多基质干扰,而图6b中烟叶基质干扰明显降低，每个物质峰清晰分开。进一步对图6a和6b中6种除草剂的回收量进行计算，得出图6b的回收量是图6a的1.2～1.63倍。可见，MIP-SPE柱提高了HPLC法对烟叶样品中磺酰脲类除草剂检测的灵敏度和准确性。

图 6 　不同预处理条件下烟叶加标样品中 6种磺酰脲类除草剂的色谱图Fig. 6 　Chromatograms of tobacco samples spiked with six sulfonylurea herbicides using different pretreatment conditions　　a. purification by NIP-SPE; b. purification by MIP-SPE.　1. ethametsulfuron (EMS); 2. MSM; 3. CS; 4. nicosulfuron (NS); 5. BSM; 6. tribenuron-methyl (TBM).

2.5　线性方程和相关系数

准确移取1.3节中配制的标准储备液于25 mL容量瓶中,用乙腈稀释并定容,得到其质量浓度分别为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00和20.00 mg/L标准工作液,用1.5节方法检测,每个样品重复检测5次,取其平均值。以质量浓度为X,对应的峰面积为Y,绘制曲线,得到各物质的线性回归方程,6种物质在此范围内呈良好的线性关系(r2=0.999 3～0.999 9)(见表1)。

表 1 　6种物质的线性方程和相关系数(r2)

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L. Linear range: 0.1-20 mg/L.

2.6　回收率、精密度和检出限

准确称取4份干燥的烟叶粉末样品,每份2.00 g,分别置于20 mL离心管中,向每份烟叶样品中添加1 mL不同浓度的CS、MSM、BSM、TBM、EMS和NS 6种磺酰脲类除草剂混合标准溶液,4份烟叶样品中每种除草剂的添加量都为0.50、5.0、30和50 μg/g。涡旋振荡均质5 min,静置渗透24 h。上述每个水平的除草剂加标样品均制作5份,做平行实验。向装有加标烟叶样品的离心管中加入10 mL二氯甲烷,涡旋振荡3 min后超声30 min,再高速离心10 min,过滤上清液并旋转蒸发至干,将所得干燥样品用1 mL乙腈溶解,经MIP-SPE柱固相萃取分离后用HPLC检测,计算各种除草剂的回收率和检测精密度,结果见表2。由表2可见,6种磺酰脲类除草剂在4个加标水平的平均回收率为77.60%～102.05%,相对标准偏差为0.16%～7.07%。6种除草剂的检出限(S/N=3)为0.08～0.46 μg/g,定量限(S/N=10)为0.29～1.54 μg/g。

2.7　实际样品检测

采用本实验建立的方法,将实际烟叶样品经CS-MIP-SPE前处理后,HPLC检测,结果见图7。所检实际烟叶样品中含有5种磺酰脲类农药残留,分别为氯磺隆、苄嘧磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆和烟嘧磺隆,其检出量均低于定量限。

表 2 　烟叶样品中6种磺酰脲类除草剂的加标回收率、相对标准偏差(n=5)、检出限和定量限

图 7 　烟叶样品中磺酰脲类除草剂的色谱图Fig. 7 　Chromatogram of sulfonylurea herbicides in a tobacco sample1. EMS; 3. CS; 4. NS; 5. BSM; 6. TBM.

3　结论

本文建立了分子印迹固相萃取-高效液相色谱同时检测烟叶中的氯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆和烟嘧磺隆等6种磺酰脲类除草剂残留分析的方法,该方法简便、快捷,能有效去除烟叶中复杂基质的干扰,提高分析的精密度和准确性,可用于实际烟叶中多种磺酰脲类除草剂的检测,同时也为其他农作物及土壤中磺酰脲类多种农药残留提供了技术支撑。