气相色谱-三重四极杆质谱同位素内标法测定鱼样中20种多氯联苯

曹艳平,　姜大峰,　李凤华,　陈金东,　李　蔚,　焦燕妮

(山东省疾病预防控制中心, 山东 济南 250014)

多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是联苯上面的氢被氯取代后的产物,它是各种氯化联苯的混合物,PCBs理论上有209种同系物异构体,目前已在商品中鉴定出130种同系物异构体单体。PCBs在自然界不易降解,经过几十年人们才逐渐认识到PCBs对全球环境的污染。PCBs对生物、人类都有极大的危害,属于脂溶性物质,通过食物链产生生物积累作用[1]。在2001年由多个国家通过的斯德哥尔摩公约中,PCBs被列为首批限制的12种对人类和自然环境最具危害的持久性有机污染物之一,各国分别禁止PCBs的生产和使用[2]。由于PCBs有持久性和难降解性,进入环境介质中和很难被分解,可通过生物富集和放大,人类处于食物链顶端,除了直接受到环境介质中PCBs的暴露影响,动植物体内的PCBs也通过食物链进入人体,对人体健康产生危害,欧盟制定了各类食品中PCBs的限值[3]。随着对限值要求的进一步严格,建立一个快速、准确、可靠的分析食品中PCBs的测定方法十分重要。

PCBs的测定方法早期有气相色谱法(GC)[4-6],后来有气相色谱-质谱法(GC-MS)[4-6]、气相色谱-高分辨质谱法(GC-HRMS)[7-10]、气相色谱-负化学源质谱法(GC-NCIMS)[11]等。随着气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(GC-MS/MS)的普及,自2014年6月起,欧盟颁布的法规[12]规定可使用气相色谱-串联质谱对食品和饲料中的二恶英样和非二恶英样PCBs的含量进行确认检验。气相色谱-串联质谱法测定PCBs有了快速的发展[13-15]。

PCBs在动植物体内主要存在于脂肪组织和富含脂肪的部位中,测定时首先要提取脂肪。脂肪中含有大量的饱和、不饱和脂肪酸等有机物,都会同时提取出来,如果进入色谱系统将导致色谱基线漂移,还会干扰PCBs的分析测定,因此去除此类干扰物质是PCBs检测的重点与难点[11,14,16]。由于PCBs含量很低,容易受到样品基质的干扰,在分析测定前要对样品预处理,以便消除基体干扰,富集待测的PCBs,提高检测的灵敏度。

目前测定PCBs的前处理方法主要包括提取和净化。提取方法有传统的索氏提取法[6,8]、加速溶剂萃取法[13]、超声辅助萃取法[15]、微波辅助萃取法[14]和超临界流体提取法[5]等。净化方法主要有硅胶、氧化铝柱净化法[6,8,13],弗罗里硅土(Florisil)、N-丙基二乙胺(PSA)、无水硫酸镁和C18等吸附剂组成的混合净化法[14],固相萃取法[17]等。

美国国家环境保护局(US EPA)方法1668A和我国GB/T 5009.190在PCBs提取时采用传统的索氏提取器提取样品18～24 h,提取的脂肪依次经过3根净化柱进行净化,每次需要预淋洗柱、洗脱目标物、洗脱液浓缩,采用高分辨气相色谱-质谱或气相色谱-质谱进行测定,在样品前处理方面花费大量时间和有机溶剂。本文在此基础上,采用自动索氏提取器提取样品中的PCBs,经一根硅胶、酸性硅胶、碱性氧化铝复合柱进行净化,只需一次浓缩过程,缩短了分析时间,减少了有机溶剂的使用量。用气相色谱-三重四极杆质谱多反应监测(MRM)模式进行测定。

1　实验部分

1.1　仪器和试剂

TSQ 8000气相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司); 460/H超声波清洗器(德国Elma公司); HR 2860食品粉碎机(Philips公司); CHRIST Alpha 2-4真空冷冻干燥机(德国Martinchrist公司); B-811自动索氏提取器和R-300旋转蒸发器(瑞士Büchi公司); N-EVAP112氮吹仪(美国Organmation Associates公司); VORTEX GENIE2涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司)。

丙酮和二氯甲烷(农残级,美国Fisher公司);正己烷(HPLC级,美国Merck公司)。无水硫酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司): 550 ℃烘烤4 h,待用;硅胶(100～200目,国药集团化学试剂有限公司):装入玻璃柱中,依次用正己烷和二氯甲烷淋洗二次后,50 ℃烘烤至干,180 ℃烘烤8～12 h,置于磨口瓶中,放入干燥器中保存。44%酸化硅胶:称取活化好的硅胶100 g,逐滴加入78.6 g浓硫酸,振至无块状物后,置于磨口瓶中,放在干燥器中保存。碱性氧化铝:660 ℃烘烤6 h,置于磨口瓶中,放在干燥器中保存。玻璃净化柱(300 mm×15 mm,带聚四氟乙烯柱塞),带有平液器。

多氯联苯标准溶液EC9605-PAR(20种,100 μg/L),包括:PCB-18(2,2′,5-trichlorobiphenyl)、PCB-28(2,4,4′-trichlorobiphenyl)、PCB-33(2′,3,4-trichlorobiphenyl)、PCB-52(2,2′,5,5′-tetrachlorobiphenyl)、PCB-44(2,2′,3,5′-tetrachlorobiphenyl)、PCB-70(2,3′,4′,5-tetrachlorobiphenyl)、PCB-101(2,2′,4,5,5′-pentachlorobiphenyl)、PCB-118(2,3′,4,4′,5-pentachlorobiphenyl)、PCB-153(2,2′,4,4′,5,5′-hexachlorobiphenyl)、PCB-105(2,3,3′,4,4′-pentachlorobiphenyl)、PCB-138(2,2′,3,4,4′,5′-hexachlorobiphenyl)、PCB-187(2,2′,3,4′,5,5′,6-heptachlorobiphenyl)、PCB-128(2,2′,3,3′,4,4′-hexachlorobiphenyl)、PCB-180(2,2′,3,4,4′,5,5′-heptachlorobiphenyl)、PCB-199(2,2′,3,3′,4,5,5′,6′-octachlorobiphenyl)、PCB-170(2,2′,3,3′,4,4′,5-heptachlorobiphenyl)、PCB-195(2,2′,3,3′,4,4′,5,6-octachlorobiphenyl)、PCB-194(2,2′,3,3′,4,4′,5,5′-octachlorobiphenyl)、PCB-206(2,2,3,3′,4,4′,5,5′,6-nonachlorobiphenyl)、PCB-209(2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6,6′-decachlorobiphenyl)。

多氯联苯定量内标标准溶液EC9605-SS(8种,2.0 mg/L)、多氯联苯回收率内标标准溶液EC9605-RS(2种,2.0 mg/L)均购自加拿大Wellington Laboratries公司。将EC9605-SS和EC9605-RS分别用异辛烷稀释至40 μg/L,作为定量内标和回收内标的使用液。

1.2　样品前处理

1.2.1样品预处理

将样品可食部分粉碎混匀后,称取样品5 g(精确至0.01 g),在冷冻干燥机中干燥后,加入10 μL 40 μg/L定量内标使用液,装入自动索氏提取器,以适量正己烷-二氯甲烷(1∶1, v/v)为提取溶剂,回流提取共60次。提取完成后,测定并计算脂肪含量。

1.2.2复合柱净化

玻璃柱从底端到顶端依次填入玻璃棉、2.5 g活化碱性氧化铝、4 g无水硫酸钠、4 g活化硅胶、10 g酸化硅胶、2 g活化硅胶、4 g无水硫酸钠。用100 mL正己烷预淋洗,用正己烷将提取到的脂肪全部转移洗至净化柱上,以180 mL正己烷洗脱,再以25 mL二氯甲烷-正己烷(5∶95, v/v)洗脱,收集洗脱液,浓缩至约1 mL。

1.2.3上机分析

将浓缩液转移至进样小瓶中,浓缩至0.5 mL,加入10 μL 40 μg/L回收内标使用液,混匀后上机分析。

1.3　分析条件

色谱柱:TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升温:初始温度100 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升至180 ℃,再以3 ℃/min升至240 ℃,再以10 ℃/min升至285 ℃,保持10 min;载气:高纯氦气;恒流模式:流速1.5 mL/min;进样口温度:250 ℃,不分流进样,进样量1.0 μL。

离子源(EI)温度:250 ℃;碰撞气:氩气;传输线温度:280 ℃;溶剂延迟时间:4 min;扫描方式:多反应监测模式。相关参数见表1。

表 1 　20种PCBs的保留时间、定量及定性离子对、碰撞能量

表 1 　(续)

1.4　计算

定量方法采用内标法,首先用回收内标计算样品中定量内标的回收率:用13C12-PCB-101作为13C12-PCB-28、13C12-PCB-52、13C12-PCB-118、13C12-PCB-153的内标,用13C12-PCB-194作为13C12-PCB-180、13C12-PCB-202、13C12-PCB-206、13C12-PCB-209的内标,样品中定量内标的回收率应在80%～120%之间。样品中定量内标的回收率应满足要求后,再用定量内标计算样品中每个待测PCBs的含量。每族PCBs使用一个相同氯代程度的同位素内标物作为定量内标:三氯联苯用13C12-PCB-28、四氯联苯用13C12-PCB-52、五氯联苯用13C12-PCB-118、六氯联苯用13C12-PCB-153、七氯联苯用13C12-PCB-180、八氯联苯用13C12-PCB-202、九氯联苯用13C12-PCB-206、十氯联苯用13C12-PCB-209作为内标。

每个批次最多每15个样品后,需做一次方法空白试验。

2　结果与讨论

2.1　样品前处理方法的优化

自动索氏提取器以正己烷-二氯甲烷(1∶1, v/v)为提取溶剂,共回流提取60次,8 h左右完成对样品中脂肪的提取。同一样品分别采用传统的索氏提取器和自动索氏提取器进行脂肪的提取(n=6),分别将提取到的脂肪均按照本文建立的方法进行净化后测定,以考察不同的提取方法对PCBs总量测定结果的影响。用传统的索氏提取器提取测定的样品脂肪含量均值是6.33%、20种PCBs的总量均值是5.77 μg/kg,用自动索氏提取器测定的样品脂肪含量均值是6.38%、20种PCBs的总量均值是5.71 μg/kg。经统计分析,两种方法对脂肪的提取没有差异,测得样品中20种PCBs的总量均值没有差异。此后脂肪提取全部采用自动索氏提取器。

2.2　分析条件的优化

PCBs是弱极性化合物,色谱柱采用弱极性毛细管柱TG-5MS,通过优化色谱柱的程序升温条件,采用三阶升温,全部20种PCBs及10种13C12-PCB同位素内标在33 min内出峰,分离良好,标准品的总离子流图见图1。

图 1 　20种PCBs标准品的总离子流图Fig. 1 　Total ion chromatogram (TIC) of the 20 PCB standards　1. PCB-18; 2. PCB-28; 3. PCB-33; 4. PCB-52; 5. PCB-44; 6. PCB-70; 7. PCB-101; 8. PCB-118; 9. PCB-153; 10. PCB-105; 11. PCB-138; 12. PCB-187; 13. PCB-128; 14. PCB-180; 15. PCB-199; 16. PCB-170; 17. PCB-195; 18. PCB-194; 19. PCB-206; 20. PCB-209.

三重四极杆质谱条件的优化主要包括母离子、子离子、碰撞能量等几个方面。分别使用0.1 μg/L的PCBs标准溶液、定量内标标准溶液、回收内标标准溶液进行方法优化,选择丰度最高的离子对;碰撞能量从5 eV到30 eV进行优化后,选择出最佳碰撞能量,见表1。

根据欧盟委员会指令[18]中有关分析方法表现的排名,GC-MS/MS方法的识别点数与HRMS相似或更高,尤其是使用基于MS/MS的独立离子对时。该指令还规定,有机物残留或污染物适用的确认方法必须是基于全扫描技术或“若方法不记录全扫谱图,则需要至少4个识别点(多氯联苯、二恶英、呋喃等)”。本方法通过使用两个一级离子的离子对,为每种PCB单体化合物提供了4个识别点,满足其规定要求。

表 2 　20种PCBs的线性范围、回归方程、相关系数(r)、检出限和定量限

2.3　净化方法的优化

本文在US EPA方法1668A的基础上,对净化方法进行了改进,采用一根多层复合净化柱,从柱底端到顶端依次填入碱性氧化铝、活化硅胶、酸化硅胶,预淋洗后,将样品提取液过柱净化,依次采用正己烷和有二氯甲烷配比的正己烷洗脱,收集合并全部洗脱液,浓缩后上机分析。一次过柱、一次浓缩过程,节省样品分析时间、减少有机溶剂的使用量。分别采用这两种方法对净化的效果进行比较,选择鱼样品中脂肪含量比较高(13.8%)的样品,两种方法均显示出良好的净化效果,没有本底干扰。同一样品按两种方法净化后测定的总离子流图见图2。

图 2 　样品经不同方法净化后的总离子流图Fig. 2 　TIC chromatograms of a sample purified by different methods　a. US EPA 1668A; b. this method.　Peak Nos. are the same as those in Fig. 1.

2.4　标准曲线、检出限和定量限

用异辛烷将EC9605-PAR逐级稀释成0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/L的系列标准溶液,各取1.0 mL,分别各加入20 μL 40 μg/L定量内标和回收内标使用液,使测定液中定量内标和回收内标均为0.8 μg/L,混匀后与样品相同仪器条件上机分析。分别将标准测定液中待测PCBs与其相应定量内标的定量离子对峰面积比值对PCBs的质量浓度进行线性回归。采用基质加标回收的方法,以信噪比(S/N)>3确定检出限(LOD),以S/N>10确定定量限(LOQ)。结果见表2。

表 2 　(续)

y: peak area ratio of the quantitative ion of each standard to the corresponding internal standard;x: mass concentration, μg/L

2.5　回收率与精密度

分别用US EPA方法1668A和本文方法进行净化,进行0.1、1.0和5.0 ng/g的加标回收试验与精密度测定(每组n=6),两种方法低、中、高3种水平下的加标回收率均在80.3%～117.6%之间,相对标准偏差(RSD)在5.09%～18.5%之间(见表3),均符合分析检测的要求。内标校正使在前处理过程中损失的目标化合物得到校正,低水平下的加标回收率也比较令人满意。两种方法的回收率与精密度无显著性差异。

表 3 　不同净化方法下20种PCBs的加标回收率(n=6)

表 3 　(续)

2.6　样品测定

采用本文方法对山东省沿海地区的常见鱼类进行了分析测定,包括黄花鱼(大、小)、鲅鱼、鲈鱼、带鱼、偏口鱼。在所有鱼样中均检出多个PCBs单体,总量在1.2～8.8 μg/kg(湿重)之间,7种指示性PCBs的含量总和在0.68～6.4 μg/kg(湿重)之间(见表4)。我国GB 2762-2017中PCBs的限量指标以7种指示性PCBs的总和计,水产动物及其制品<0.5 mg/kg。山东省沿海常见鱼中PCBs的检出量没有超出国家标准限值。

表 4 　鱼样中PCBs的含量

3　结论

本文建立了气相色谱-三重四极杆质谱多反应监测模式测定鱼样中PCBs的方法,采用自动索氏提取器提取PCBs,用一根多层复合净化柱净化,净化效果好,缩短了分析时间,减少了有机溶剂使用量,降低了复杂本底对检测结果的干扰,提高了检测灵敏度。该方法适用于鱼样中PCBs的检测。