菝葜皂苷对胃癌BGC-823细胞Bcl-2、Bax凋亡蛋白表达影响的实验研究

廖子君* 郑 琪 赵 征 孙海凤 龙 婧 陈 勇

（西安交通大学医学院附属陕西省肿瘤医院，陕西 西安 710061）

菝葜为百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎，其主要成分是皂苷，且是以薯蓣皂苷元（菝葜皂苷元，sarsasapogenin，SAR））为主要苷元所衍生的皂苷。近年来，有学者对菝葜皂苷元诱导肝癌细胞HepG2凋亡进行了研究，获得了阳性结果[1-2]。为了明确菝葜皂苷元对胃癌细胞是否具有诱导凋亡作用，我们进行了SAR对胃癌BGC-823细胞株Bcl-2、Bax凋亡蛋白表达水平影响的实验研究，旨在寻找胃癌非细胞毒治疗新药。

1 材料与方法

1.1 细胞株：胃癌BGC-823细胞株（美国ATCC公司），在含10%的胎牛血清的RPMI1640培养液中培养，其内加入青霉素（100 μmol/L）、链霉素（100 μmol/L），置于5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，0.25%胰酶消化传代。

1.2 药物与试剂：SAR购于中国药品生物制品鉴定所（批号：110744-200509），用二甲基亚砜（DMSO）溶解，然后根据实验需要用RPMI-1640培养液稀释成实验所需的不同浓度，其中DMSO含量均为1%，-20 ℃保存；RPMI-1640培养液；Bcl-2、Bax单克隆抗体，SP免疫组化试剂盒。

1.3 实验方法：采用免疫细胞化学法检测不同浓度12.5、25、50 μg/mL SAR对BGC-823细胞株Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。按4×104/mL的密度将BGC-823细胞接种到放有盖玻片的24孔板内，1 mL/孔；加入不同浓度SAR的RPMI1640培养液，对照组加入不含SAR的RPMI 1640培养液。一抗4 ℃过夜，次日复温、洗涤后滴加二抗。用PBS代替一抗设置对照。在辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，DAB染色，苏木素复染细胞核。

结果判定标准：Bax、Bcl-2均在细胞胞质表达，呈棕黄色，空白对照呈阴性。10×20倍镜下随机取5个视野，计算每个视野阳性细胞数，平均阳性细胞数占总计数细胞的10%以上者为阳性，平均阳性细胞数＜10%者为阴性（包括没有或仅有弱的染色），阳性反应者用德国LeicaQ550cw图像分析系统在统一光强，统一放大倍数（10×20）下测量表达情况，以染色最淡的视野为起点，随机选取视野测定其灰度值（灰度值与实际表达强度呈反比，即灰度值越低，阳性表达越强；灰度值越高，阳性表达越弱）。作为Bax、Bcl-2阳性表达的量化指标，并进行统计学分析。

2 结 果

不同浓度12.5、25、50 μg/mL的SAR处理BGC-823细胞48 h后，经灰度分析可知，不同浓度SAR与对照组比较，均有统计学意义（P＜0.05），且Bax与SAR浓度呈正相关，Bcl-2与SAR浓度呈负相关，即随着SAR浓度的增加，bax表达增加而bcl-2表达减少（见图1和图2、表1）。

3 讨 论

图1 各组BGC-823细胞bcl-2表达（IHC×200）

表1 SAR对BGC-823胃癌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响（±s）

表1 SAR对BGC-823胃癌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响（±s）

注：SAR不同浓度组与对照组比较，以及不同浓度组之间比较均是P＜0.05

groups Concentration of drug(μg/mL) Bcl-2 Bax Comparison group — 195.35±8.46 140.31±7.23 Experiment groups 12.5 181.44±9.14 153.16±8.37 25 172.43±8.26 168.97±7.56 50 150.79±9.57 185.76±7.48

2005年《Cancer J Clin》报道，2002年全球胃癌发病率位居第4位，病死率第2位；美国1930年～2004年胃癌总体发病率与病死率呈显著下降趋势，而中国每年胃癌新发病例占全部恶性肿瘤发病的17%以上，其病死率一直居高不下，仅次于肺癌[3]；2010年，中国肿瘤登记年报资料显示，覆盖2007年人口约5981万，17个城市地区，21个农村地区，发病率前5位肿瘤为肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌。2017年1月25日，国家癌症中心、全国肿瘤防治研究办公室、全国肿瘤登记中心发表了《2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析》，报告称2012年我国胃癌新发病例男性为29.8万，位居第二；女性12.6万，位居第四。因此，胃癌迄今仍是全球人口主要癌症死亡原因[4]。有40%～50%胃癌患者明确诊断时已是局部晚期，无法行根治性切除，甚或远处转移，即使行根治性切除，远期亦有40%以上的患者复发，复发的患者中约超过80%的患者有远处转移[5]。

近年来，为了延长中、晚期胃癌患者生存期、提高其生活质量，人们进行了大量探索，但均未有重大突破。笔者试图从来自于天然植物的抗肿瘤活性成分中寻找对胃癌有治疗作用的药物，尤其对晚期胃癌合并恶液质的患者有一定缓解作用。

SAR是一种低毒的抗肿瘤活性成分，非细胞毒药物。国内有学者研究证实[2-3]，SAR能诱导肝癌HepG2细胞发生凋亡，是一种由ROS作为早期信号所触发的，并通过线粒体介导的过程。此外，SAR可在体外较显著地降低酪氨酸激酶的活性。因此，推测SAR可能通过抑制细胞的信号转导通路来诱导细胞凋亡。凌博凡等[6]的研究发现，菝葜皂苷元作用于人结肠癌LoVo细胞48 h后可诱导该细胞凋亡，阻滞细胞于G2/M期；其诱导细胞凋亡时伴随着线粒体膜电位的降低，认为诱导凋亡的途径可能与线粒体通路有关。

细胞凋亡受细胞内一系列基因的网络式精细调控，在细胞凋亡的调控因素中，Bcl-2家族基因倍受瞩目，其中Bcl-2基因是原癌基因，其突出作用是抑制细胞凋亡，Bcl-2蛋白广泛存在于细胞的线粒体膜、细胞膜内表面、内质网、核膜等处[7]。Bax一方面能和Bcl-2形成异源二聚体抑制凋亡，另一方面其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡。

图2 各组BGC-823细胞bax表达（IHC，×200）

前期研究表明[8]，SAR对胃癌BGC-823细胞株有抑制生长作用，在MTT实验中观察到，随着作用浓度的增加与时间的延长，这种增殖抑制作用愈明显，与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）；应用AnnexinV-PI双标法检测到SAR可以明显诱导BGC-823细胞发生凋亡，BGC-823胃癌细胞在SAR浓度为50 μg/mL、作用时间为72 h时的凋亡率达到39.43%，与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。

本研究是在该课题前期研究的基础上，采用流式细胞仪检测、观察不同浓度SAR对BGC-823细胞株凋亡的影响，以及进一步应用免疫细胞化学法联合灰度分析对Bax、Bcl-2阳性表达进行量化分析。研究结果发现，不同浓度12.5、25、50 μg/mL的SAR处理BGC-823细胞48 h后，经灰度分析，不同浓度SAR与对照组比较，均有统计学意义（P＜0.05），且Bax与SAR浓度呈正相关，Bcl-2与SAR浓度呈负相关，即随着浓度的增加，bax表达增加而bcl-2表达减少。该研究提示，SAR具有诱导胃癌BGC-823细胞凋亡的作用。本研究为菝葜皂甙的进一步开发奠定了理论基础。