上皮性卵巢癌中MRP1、BCRP、BRCA1基因的表达及其意义

杨 军，彭 梅

(1.四川省凉山彝族自治州第二人民医院检验科，四川 西昌 615000；2.四川大学华西广安医院检验科，四川 广安 638000)

卵巢癌是女性常见的三大恶性肿瘤之一，由于临床症状不明显，发病较为隐匿，大部分患者来院就诊时已属晚期[1]。临床资料表明，上皮性卵巢癌的发病率约占卵巢癌总发病数的90%[2]。目前临床对于上皮性卵巢癌的治疗多采用手术联合化疗的方案，但近年来发现，约有25%的卵巢癌患者对化疗药物存在原发耐药，60%以上的患者存在继发性耐药[3]。尽管近年来卵巢癌患者通过化疗5年生存率已有所提高，但由于化疗耐药的存在导致5年生存率只有20%[4]。因此，对上皮性卵巢癌化疗耐药的机制进行探讨，为上皮性卵巢癌的化疗用药提供指导是当前研究较为热门的课题。研究表明，多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、乳腺癌易患基因1(breast cancer 1，early onset，BRCA1)可能与上皮性卵巢癌的化疗耐药及预后相关[5～7]，本研究对MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌中的表达及其意义进行研究。

1 资料与方法

1.1一般资料2013年3月至2016年5月在我院实施手术治疗的47例上皮性卵巢癌患者。纳入标准[8]:①经病理检查确诊为上皮性卵巢癌；②术前未进行过化疗，术后实施以顺铂为基础的化疗6个疗程。年龄25～68岁[(49.3±4.2)岁]。根据耐药情况分为两组，其中耐药组22例，年龄25～67岁[(48.7±3.5)岁]；敏感组25例，年龄26～68岁[(49.1±3.2)岁]。另选20例正常卵巢组织标本作为对照组，标本来自子宫肌瘤实施子宫和附件切除手术并经病理检查确定卵巢组织正常者，年龄25～66岁[(48.8±3.1)岁]。三组研究对象的基础资料比较，差异无统计学意义(P> 0.05)，具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有受试者均知情同意并自愿签署同意书。

1.2材料与试剂Trizol试剂(美国Invitrogen公司，批号:15596026)、氯仿(北京化学试剂厂，批号:1041191)，异丙醇(北京化学试剂厂，批号:GF0516)、乙醇(北京化学试剂厂，批号:GF0498)反转录试剂盒(美国Promega公司，批号:A3500)、实时荧光定量PCR反转录试剂盒(美国Promega公司，批号:A5003)、实时荧光定量PCR引物(美国Invitrogen公司，批号:F02001)、0.1%二乙基焦磷酰胺水(实验室自制)。

1.3方法采用实时荧光定量PCR技术对上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中MRP1、BCRP、BRCA1基因的表达情况进行检测:①无菌条件下用剪刀获取组织并置于液氮盒内，冻存于-80 ℃冰箱；②经研磨匀浆、分层、RNA洗涤、沉淀及RNA溶解保存提取组织总RNA；③采用核酸定量对组织总RNA的浓度和纯度进行测定；④RNA反转录为cDNA、目的基因扩增，分两步完成对MRP1、BCRP、BRCA1基因的测定。

1.4化疗耐药的判定化疗疗效通过盆腔和腹部检查、糖类抗原125水平，并结合超声、CT或二次探查术所见评价。当初次化疗后未出现临床证实的缓解(即临床症状仍存在，盆腔或超声检查仍有包块，血清糖类抗原125未下降至正常水平)或在化疗后6个月内出现复发即可判定为耐药。

1.5统计学方法应用SPSS 17.0软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本的t检验，计数资料的比较采用χ2检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MRP1、BCRP、BRCA1表达的比较MRP1和BCRP在上皮性卵巢癌组织中的表达量与表达率均高于正常卵巢组织(P< 0.05)。BRCA1在上皮性卵巢癌组织中的表达量和表达率与正常卵巢组织比较差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1、2，图1。

2.2MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐药组与敏感组中的表达情况耐药组MRP1、BCRP及BRCA1的表达量和表达率均高于敏感组(P< 0.05)。见表3、4，图2。

表1 上皮性卵巢癌组织与正常卵巢组织中MRP1、BCRP、BRCA1相对表达量比较

图1 两组MRP1、BCRP、BRCA1 mRNA电泳结果(1～3为上皮性卵巢癌组织；4～6为正常卵巢组织)

表2 上皮性卵巢癌组织与正常卵巢组织中MRP1、BCRP、BRCA1表达率比较 [n(%)]

表3 MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐药组与敏感组的相对表达量

表4 MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐药组与敏感组的表达率比较 [n(%)]

图2 两组MRP1、BCRP、BRCA1 mRNA电泳结果(1～3为耐药组；4～6为敏感组)

3 讨论

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，也是预后最差的恶性肿瘤之一。尽管临床上通常采用手术治疗，但术后化疗仍然是治疗的重要手段。卵巢癌患者的预后情况直接取决于其对化疗的反应，近年来随着各类化疗药物和技术的应用，卵巢癌患者初始化疗反应率可达80%，但由于耐药的存在，卵巢癌患者的5年生存率仍然较低，只有30%[9，10]。化疗耐药目前已成为影响卵巢癌患者预后的重要因素[11]，研究发现[12]，20%～30%的上皮性卵巢癌患者为原发铂类耐药，80%的患者在治疗过程中出现耐药。肿瘤细胞对化疗耐药是多方面的，包括:①增强DNA损伤的耐受性与损伤后的自我修复[13]；②增强药物的外排，减少药物在细胞内的积聚；③促进药物失活。耐药基因的异常表达是肿瘤耐药的一个重要方面，基于此，近年来很多医院将卵巢癌耐药基因的表达作为监测、评估患者预后的重要指标[14]。MRP1、BCRP和BRCA1是临床已经证实的与化疗耐药相关的基因[15～17]，而关于其在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与耐药的关系尚未见相关报道，本研究就此进行探讨。

MRP1蛋白是一种多药耐药相关蛋白，与药物转运有关，属于ATP-结合盒超家族成员，其主要功能是将细胞内带负电荷的分子排出胞外。化疗药物在细胞内被代谢成带负电荷的离子，从而被MRP1蛋白转移至胞外，进而无法发挥作用。这是MRP1介导的化疗耐药的主要作用途径。MRP1蛋白的高表达可导致非P-糖蛋白介导的多药耐药。本研究表明，MRP1在上皮性卵巢癌组织中的表达量和表达率均较正常卵巢组织升高，这与黄好亮等[18]和陈亮等[19]的研究结果一致。本研究还发现，耐药组患者MRP1的表达量和表达率均显著高于敏感组，其机制可能是顺铂类化疗药物能够诱导上皮性卵巢癌组织过量表达MRP1，而过量MRP1能提高转运负电荷药物能力，降低细胞内药物浓度，进而降低临床疗效，可能提高患者耐药性。

BCRP属于ATP-结合盒膜转运蛋白超家族成员。BCRP可介导上皮性卵巢癌的耐药，但相对于金属蛋白酶、P-糖蛋白等ATP-结合盒膜转运蛋白超家族的其他成员，BCRP介导的是非典型耐药，随着BCRP表达的增高，BCRP细胞对甲氨蝶呤、吡柔比星、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷等抗癌药的耐药指数增加，但其在人体正常的作用尚不明确[20]。本研究显示，BCRP在上皮性卵巢癌组织中的表达量、表达率均低于正常卵巢组织，其中耐药组中的表达率也低于敏感组，这可能是由于BCRP在化疗生存中有一定的保护作用，而目前卵巢癌组织中的BCRP的研究甚少，BCRA是否能预测化疗药物耐药敏感仍是热点问题。

本研究显示，BRCA1在上皮性卵巢癌组织中的表达量和表达率与正常卵巢组织相比差异均无统计学意义。与吴氢凯等[21]的研究结果一致。此外，耐药组患者BRCA1的表达量和表达率均明显高于敏感组，说明BRCA1的高表达会抑制化疗药物功能的发挥，其原因可能是因为BRCA1能够增强细胞的修复能力，从而使细胞产生耐药性而不易被化疗药物杀死。

综上所述，MRP1，BCRP在上皮性卵巢癌组织中的表达量会显著增加，BRCA1表达量变化不显著。三种基因表达量增加均与化疗耐药的产生有关。