肝组织病毒学检测对血清HCV RNA阴性慢性HCV感染者诊治价值探讨

寇 艳，纪风兵，范 凌，罗凤莲

(成都医学院第一附属医院感染科，四川 成都 610500)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的病毒性感染，主要经针刺、吸毒、血液系统传播[1]。统计显示，世界范围内HCV感染率约为3%，每年新发丙型肝炎病例逾3万人次，可引起肝脏慢性组织炎症及肝纤维化，严重者可能进展为肝硬化及肝细胞肝癌，威胁患者生命安全[2]。目前用于HCV感染的常规检测方法包括抗-HCV及血清HCV RNA定量检测，其中抗HCV产生是HCV感染的重要标志，但研究发现，抗-HCV检测特异性较低，受机体免疫状态影响较大[3]。而血清HCV RNA定量则可直接测定患者外周HCV RNA水平，有较高的特异性，可确诊HCV感染，监测HCV病毒复制及抗病毒免疫应答状况。但受到机体免疫差异、血清HCV RNA水平低、肝硬化HCV复制空间有限等因素的影响，部分HCV感染患者无法检出血清HCV RNA阳性，一般将此类患者成为隐匿性HCV感染。对部分血清学HCV RNA阴性但易出现外周血细胞减少症、脾肿大及肝脏形态学改变的患者，若未及时确诊，导致治疗延误，则可引起病情不可逆进展，严重影响患者预后[4]。本研究对血清学HCV RNA常规检查无法明确慢性HCV感染的肝病患者展开经皮穿刺肝组织活检，进行肝组织HCV RNA定量及基因型检查，旨在明确血清学HCV RNA阴性慢性HCV感染患者肝组织HCV RNA阳性情况，并指导抗病毒治疗，以评价肝组织病毒学检测对血清HCV RNA阴性慢性HCV感染患者的临床诊疗价值。

1 资料与方法

1.1一般资料2012年2月至2015年5月我院收治的46例血清HCV RNA阴性慢性HCV感染患者。纳入标准：抗-HCV阳性，伴或不伴肝功能影像学异常、肝功能异常，或抗-HCV阴性，但伴反复肝功能异常或肝脏影像学异常；连续测定3次血清HCV RNA阴性；无经皮穿肝组织活检禁忌证；获得患者及家属知情同意。排除标准：无法配合经皮肝穿活检者；既往有不明原因出血史或有出血倾向者；合并肝血管瘤或其他血管性肿瘤者；无法确定合适穿刺点者；合并肝包虫病者；合并凝血功能障碍者；入组10天内应用非甾体类抗炎药物者；合并大量腹水者；腹腔、胸腔严重感染者；合并自身免疫功能缺陷者；有症状性心脏病者；既往接受抗病毒治疗者；合并乙型肝炎病毒(HBV)感染、代谢性肝病、药物性肝病等；失代偿期肝硬化者；合并精神疾病者；妊娠或哺乳期女性。其中男20例，女26例；年龄22～75岁[(46.6±5.7)岁]；体重指数(BMI)(25.5±4.5)kg/m2；谷丙转氨酶(ALT)(139.5±59.5)IU/L，甘油三酯(TG)(2.8±1.8)mmol/L；血糖(6.8±3.3)mmol/L。

1.2方法①肝组织HCV RNA测定。所有患者入院后均行凝血常规、血常规及肝脏影像学检查，确定无经皮穿刺肝组织活检禁忌证。在彩色多普勒超声指导下定位穿刺点，确定穿刺深度，常规消毒穿刺点周围皮肤，无菌铺巾，1%利多卡因局部浸润麻醉，麻醉起效后采用18 G半自动活检肝穿刺针行快速经皮穿刺肝组织活检，均取材2次，肝组织标本长度超过15 mm，福尔马林溶液固定，脱水，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，经行HE、Masson及嗜银网状纤维染色，光镜下观察，进行肝组织病理炎症坏死评分(Knodell HAI评分系统)及肝纤维评分(Ishak评分)。并留取外周血标本，血清HCV RNA、肝组织HCV RNA定量采用荧光定量聚合酶联反应法(PCR)，采用罗氏公司LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR系统进行测定，试剂盒购自深圳凯杰生物工程有限公司。②血清抗-HCV测定。均留取外周血标本，采用酶联免疫法测定抗-HCV，试剂盒购自中山生物工程有限公司，采用SEAC公司Alisei全自动酶免分析系统测定，样品光密度值(OD值)≥临界值(cut-off值)视为抗-HCV阳性，比较抗-HCV阳性或阴性患者肝组织HCV RNA阳性情况。③HCV基因分型测定。采用测序法测定HCV基因分型，提取HCV RNA，试剂盒购自Qiagen公司，行HCV Core/E1荧光定量PCR扩增，引物由上海英骏生物技术有限公司设计及合成，采用MJ Reasearch公司PTC-420型全自动PCR扩增仪，核酸测序以荧光定量PCR扩增产物为模板，测序引物同扩增引物，HCV基因分型采用MEGA5序列分析软件及NCBI在线基因分型工具。④抗病毒治疗。对基因1型患者采用聚乙二醇干扰素α-2a(瑞士 Roche Pharma (Schweiz) Ltd，国药准字S20120047)联合利巴韦林(中国药科大学制药有限公司生产，国药准字H10970280)治疗，聚乙二醇干扰素α-2a，皮下注射，180 μg，1次/周；利巴韦林，1000 mg/d，分2次口服，肝组织Ishak纤维化评分≤4分者，疗程为12个月，并随访6个月；肝组织纤维化评分>4分者疗程为18个月，随访6个月。非基因1型者皮下注射聚乙二醇干扰素α-2a，180 μg，1次/周；利巴韦林，800 mg/d，分2次口服，疗程6个月，随访6个月。治疗过程严密监测血常规，酌情调整药物剂量或停药。

1.3评价标准①肝组织病理炎症坏死评分。参照Knodell HAI评分系统[5]，内容包括汇管周围坏死(10分)、肝小叶内变性和灶状坏死(4分)、汇管区炎症(4分)，总分18分，评分越高，表示肝组织病理炎症坏死程度越高。②肝纤维评分。参照Ishak评分[6]，共0～6分，表示无纤维化、某些区域纤维化、大部分汇管区纤维化扩展、大部分汇管区桥样纤维扩展、明显纤维化扩展、明显桥样纤维化伴小结节、可能或肯定存在纤维化。分别于抗病毒治疗前、末次随访进行上述评分，评估抗病毒治疗效果，并统计患者肝组织病毒学阴转率。

1.4统计学方法采用SPSS 19.0软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，计量资料比较采用t检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1抗-HCV阳性或阴性患者肝组织HCVRNA阳性率比较 46例患者肝组织HCV RNA阳性33例，阳性率71.74%；抗-HCV阳性41例(89.13%)，阴性5例(10.87%)。抗-HCV阳性患者肝组织HCV RNA阳性率为75.61%，抗-HCV阴性患者肝组织HCV RNA阳性率为40.00%，差异无统计学意义(χ2=2.787，P> 0.05)，见表1。

表1 抗-HCV阳性或阴性患者肝组织HCV RNA阳性率比较[n(%)]

2.2肝组织HCVRNA阳性患者HCV基因型分布33例肝组织HCV RNA阳性患者中HCV基因型为1型者18例，(54.55%)，非1型15例(45.45%)，其中包括基因2型9例(27.27%)，基因3型6例(18.18%)。

2.3肝组织KnodellHAI评分、Ishak评分比较抗病毒治疗前，患者肝组织Knodell HAI评分、Ishak评分处于较高水平，末次随访，患者肝组织Knodell HAI评分、Ishak评分均降低，与治疗前比较差异有统计学意义(P< 0.05)，见表2。

表2 抗病毒治疗前后患者肝组织Knodell HAI评分、Ishak评分比较(分)

2.4不同HCV基因型患者肝组织HCVRNA阴转率比较非1型慢性HCV感染患者末次随访肝组织HCV RNA阴转率高于1型慢性HCV感染患者(χ2=4.332，P< 0.05)，见表3。

表3 不同HCV基因型患者肝组织HCV RNA阴转率比较[n(%)]

3 讨论

丙型肝炎为HCV感染所致传染病类型，以血液传播为主要途径，早期症状不典型，起病隐匿，易漏诊，延误治疗，影响患者预后[7]。早期确诊HCV感染，则可为丙型肝炎传播控制奠定基础。目前用于丙型肝炎HCV感染检测的方式包括HCV抗体检测、HCV RNA测定及HCV基因型测定[8]，其中抗HCV抗体检测是最早用于HCV感染诊断的方式，其操作简单，耗时短，但假阳性率高，特异性低[9]。Bradshaw等[10]报道发现，抗-HCV阴性丙型肝炎患者可在肝组织检出HCV RNA复制，而血清学HCV RNA虽特异性较高，但受到免疫因素、肝硬化病情、血清内HCV RNA低水平等影响，部分HCV感染患者血清核心抗原大部分被病毒包膜蛋白覆盖，导致血清内HCV RNA含量极低，且HCV属单链RNA病毒，基因突变率高，变异性强，导致HCV核心抗原无法特异性扩增靶物质，无法放大检测信号，引起漏诊[11，12]。且HCV急性感染伴免疫缺陷患者，HCV感染后抗体出现时间晚，浓度低，无法筛出HCV RNA。朱庆峰等[13]报道，部分原因未明持续性肝功能异常慢性肝病患者血清HCV RNA阴性者肝组织存在HCV RNA病毒复制。HCV属黄病毒科，为嗜肝型病毒，HCV感染后HCV先经肝细胞膜释放，随后进入血液系统，并在外周血中检出HCV RNA[14]，因此认为，肝组织HCV RNA病毒学变化可能先于血清学改变[15，16]。

本研究结果发现，46例患者HCV RNA阴性患者肝组织HCV RNA阳性33例，阳性率为71.74%，表明血清HCV RNA检测无法完全替代肝组织病理活检。同时对抗-HCV阳性及阴性患者肝组织HCV RNA进行检测发现，抗-HCV阴性患者仍有一定比例的肝组织HCV RNA阳性率，与常静霞等[17]报道结论相似，提示常规抗-HCV检测对HCV感染存在一定的局限性，即便抗-HCV阴性的患者亦无法完全排除HCV感染，因此对有明显肝功能损伤但抗-HCV阴性者需进一步行经皮穿刺肝组织活检，尽早确诊丙型感染，为患者临床治疗提供指导。同时本研究对所有肝组织病毒学确诊为HCV RNA阳性患者进行抗病毒治疗，并根据患者不同基因分型采用不用剂量药物干预，结果显示，末次随访所有患者肝组织病理炎症坏死评分、肝纤维化评分均显著降低，且非1型HCV感染患者末次随访病毒学阴转率较高，达80.00%，与王江南等[18]报道的76.7%相似，肯定了肝组织病理学检测对慢性HCV感染抗病毒治疗的指导价值。

综上所述，对血清HCV RNA阴性、抗-HCV阴性且原因不明反复肝功能异常患者，建议行经皮穿刺肝组织活检，对肝组织炎症坏死程度及纤维化程度进行评估，并行肝组织HCV RNA定量测定，对肝组织HCV RNA阳性者予抗病毒治疗，可延缓患者病情进展，提高HCV RNA阴转率，有助于改善患者预后。