脑动静脉畸形直径与载脂蛋白E启动子基因多态性相关性研究

殷 成，何宗泽，何 森

(四川省医学科学院·四川省人民医院神经外科，四川 成都 610072)

脑动静脉畸形(Cerebral arteriovenous malformation，AVM)为一种起病突然且常导致患者致残致死的严重脑血管疾病。目前研究发现AVM的形成可能与胚胎形成、生长发育及各种颅内疾病等多种因素相关[1]，但其准确发病原因尚未被阐明。人类载脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)俗称apoE蛋白，脑中apoE含量在人体中位居第二[2]，已有研究证实APOE参与了多种脑出血相关疾病的病理过程[3]。众所周知某个基因是否表达及表达量取决于特定的启动子启动过程，APOE基因的表达同样受其启动子调控，目前认为在APOE启动子区存在多个位点的多态性，而以-219 G/T、-427 T/C和-491 A/T最为重要[4，5]，上述启动子区域可在体内通过各种等位形式调控APOE基因的表达量及组织特异性等，因而该区域的多态性可能影响中脑血管疾病的发病与转归。因此，本研究拟从启动子的基因多态性这个全新角度去探索AVM与APOE基因型多态性形之间的关系，以求发现AVM在基因启动子水平可能存在的发病机理。

1 资料与方法

1.1一般资料四川省人民医院神经外科2015年5月至2018年1月收治的AVM住院患者137例，纳入标准：①经CTA证实的脑AVM；②未出血或首次自发出血的患者：③临床资料记录完整。排除标准：①脊髓动静脉畸形；②首次出血后再出血脑AVM患者；③出血后存活不足3天的病例。记录患者的年龄，患高血压和高血脂与否等基础临床资料，同时，所有患者均予以相应的对症支持治疗。该研究得到医学伦理委员会的批准，同时获得患者本人或家属(患者意识障碍)的同意。

1.2脑动静脉畸形描述①AVM大小分级，参阅Spetzler-Martin分级法，将CTA图像所示病变最大直径为参考标准，分为≤3 cm和>3 cm两种情况；②依据畸形血管团的引流静脉情况分为：仅存在脑表浅静脉引流和有深部静脉引流两种类型；③依据畸形血管团是否邻近脑功能区(感觉运动、语言和视觉皮层，下丘脑和丘脑，内囊，脑干，小脑脚，小脑深部神经核)分为：邻近脑功能区和不邻近脑功能区两种类型。

1.3APOE启动子基因型的鉴定该流程中患者资料和实验人员之间为双盲状态。采集患者右侧肘部静脉血后使用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)技术检测。先将血液中全DNA抽提出(DNA抽提试剂盒，Takara公司，日本)，使用引物上游5’-CAAGGTCACACAGCTGGCAAC-3’； 下游5’-TCCAATCGACGGCTAGCTACC-3’，扩增得到1423bp的PCR产物(命名为TrDNA)。随后使用引物上游5’-CAGAATGGAGGAGGTGTCCG-3’下游5’-GGAGGTGGGGCATAGAGGTCT-3’扩增上述TrDNA，将得到93bp的产物使用MspI内切酶(Takara公司，日本)酶切并凝胶电泳分离，-219 G/T分型为：74bp为G等位基因，93bp的为T等位基因。进一步使用引物上游5'-TGTTGGCCAGGCTGGTTTTAA-3’，下游5'-CTTCCTTTCCTGACCCTGTCC-3’扩增TrDNA，将228bp的产物使用AIu I内切酶(Takara公司，日本)和Dra I内切酶(Takara公司，日本)酶切并电泳分离。-427 T/C分型：144bp和84bp为T等位基因，228bp为C等位基因；-49lA/T型：228bp为T等位基因，200bp和28bp的为A等位基因。

1.4统计学方法统计数据分析采用SPSS 13.0软件。计数资料以百分数表示，比较采用卡方检验。危险因素分析采用Logistic多元回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1APOE启动子基因型分布本组137例AVM患者的基因型中，APOE启动子区多态性-219 G/T、-427 T/C、-491 A/T及等位基因频率见表1，其分布均符合遗传学Hardy-Weinberg规律(P> 0.05)，即该研究样本为遗传平衡群体。

表1 APOE启动子基因型分布

2.2APOE启动子多态性与AVM直径本研究纳入脑AVM患者137例，其中86例患者AVM直径≤3 cm，51例患者AVM直径>3 cm，检测所有患者的APOE基因启动子的多态性。结果提示：①携带有启动子-219 G/T或-427 T/C的患者，其AVM直径>3 cm的发生率无明显不同(P> 0.05)；②130例携带有-491 A的患者中，其AVM直径>3 cm比例为37.12%，其远高于27例携带有-491 T的患者中5例的AVM直径>3 cm比例18.52%(P= 0.011)。见表2。

2.3AVM患者相关临床资料和AVM直径在本次纳入的全部AVM患者中，平均年龄为31.3岁，男73例，女64例，其中有51例患者AVM直径>3 cm，而86例患者AVM直径≤3 cm。结果发现在上述AVM直径≥73 cm和直径≤3 cm组中，其指标涉及年龄、性别、血压、血脂、病变是否临近脑功能区以及是否深静脉引流，构成上差异无统计学意义(P> 0.05)，见表3。

2.4临床因素和APOE启动子亚型单与AVM直径的Logistic回归分析在进行单因素Logistic回归分析时，深静脉引流与AVM直径存在相关性，-491 A也与AVM直径>3 cm存在相关性，是AVM直径>3 cm的危险因素，而其余启动子亚型与AVM直径>3 cm未表现出相关性。多因素Logistic回归分析仍然发现-491 A是AVM直径大于3 cm的危险因素(P= 0.012，OR=1.876，95%CI 0.423～1.709)。

表2 APOE启动子多态性和AVM直径的关系 [n(%)]

表3 137例患者临床资料与AVM直径

表4 各因素与AVM的Logistic回归分析

3 讨论

本研究纳入137例诊断为AVM的患者，其中有51例患者AVM直径>3 cm，统计分析提示携带有-491 A的患者AVM直径>3 cm比例显著高于携带有-491 T的患者，且单因素和多因素的Logistic回归分析发现-491 A是AVM直径>3 cm的危险因素。

脑动静脉畸形是位于脑实质中的动静脉畸形，其畸形血管团位于与有重要功能的脑组织区域相临概率高，因为大体积病变会对脑组织造成压迫效应，此外因AVM盗血导致其原供血区脑组织的慢性缺血，若畸形血管团破裂出血则对周围脑组织造成毁灭性后果[6]。目前针对AVM的治疗手段包括开颅手术切除、血管内介入栓塞和伽玛刀照射治疗等[7，8]，而血管畸形病变本身的大小仍是用来确定治疗手段的重要参考指标，因此本研究将AVM分为>3 cm和≤3 cm两个组别来进行研究。

既往研究发现很大比例的脑AVM是散发的，然而，随后的证据支持家庭遗传因素影响了脑AVM的表型，并支持基因的多态性与该疾病相关[9]。蛋白质表达和功能也许被生物体内普遍存在的基因多态性精确调控，并最终导致人类具体疾病相关外在表型的改变[10]。例如：有研究发现ALK-1包含的内含子多态性在脑AVM中存在较高的频率[11]。其它基因或单核苷酸多态性也影响颅内出血[12]、诊断后的颅内再出血[13]、以及颅内出血后的治疗效果[14]等脑AVM的主要临床过程。上述研究结果证实了脑AVM与基因多态性存在明显的联系，但与人类中枢神经系统关系极为密切的apoE蛋白尚未得到足够关注。人类apoE蛋白在脑中的总含量位居各个器官中第二位[2]。人体中APOE存在三个等位基因ε2，ε3，ε4，与之相对应则有三个apoE蛋白亚型apoE 2，apoE 3，和apoE 4，三者相互之间仅有一个氨基酸位点不同[15]，却存在截然不同的生物学效应。已有研究证明apoE的不同亚型与脑AVM的临床表现存在联系。Pawlikowska等发现APOEε2携带者的动静脉破裂出血率为非携带者的5倍[13]。Achrol等的研究纳入了经历了手术、介入或栓塞治疗后AVM的患者，结果发现携带APOEε2的患者其治疗后再出血的风险是非携带者的3.2倍，而且该风险仅存在于非手术治疗组[14]，上述研究提示脑AVM出血与APOE基因多态性存在明显关联，但脑AVM的其他特性与APOE的关系尚未被报道，同时能调控APOE基因转录和蛋白表达的APOE基因启动子[16]在脑AVM中扮演的角色则从未曾揭示。而在本研究中，则开拓性地探究了APOE基因启动子多态性和脑AVM之间的关系。

ApoE为载脂蛋白，通过与其受体结合而在细胞及组织间转运脂质为其基本功能，而人体动静脉血管作为运送血液的机械管道则主要由内皮细胞、纤维蛋白等组成，二者之间表面上似乎不存在联系，但本研究却发现脑AVM和患者携带有APOE启动子-491 A相关，该结果可能有如下两点潜在意义。首先，脑AVM的发生有可能与颅内的脂质代谢相关。在成年人群中，脂质和血管相关性疾病已被广泛关注，尤其是导致多个脏器病变的动脉粥样硬化；而在胚胎时期，也有研究提示脂质与颅内血管发育相关，Harland等报道在小鸡胚胎发育过程中，作为脂质的前列腺素影响了大血管直径[17]，因此推测apoE与脑AVM形成过程存在关联。其次，载脂蛋白apoE在脑AVM的发生过程中，很可能不仅仅扮演了其搬运脂质的作用，而更可能参与了脑AVM发生过程中的分子信号通路调节。基于脑AVM可能为先天发育异常，而个体基因在受精卵时期已定型，因此APOE启动子有可能在胚胎发育期间即开始扮演其负面角色，通过影响apoE进而干预信号通路调节。

综上所述，本研究尽管首次揭示了在分子层面的APOE启动子与脑AVM大小的关系，但APOE启动子如何在AVM的病理生理过程中发挥作用以及其可能的分子调控机制仍有待于阐明，以期继而能助于脑AVM的预防和治疗。