益生菌补充改善吡嗪酰胺致大鼠肝损伤及肠道菌群紊乱的效果

李园园，郝海波，刘加洪，葛 冰，马爱国,

（1.青岛大学公共卫生学院，山东 青岛 266021；2.青岛市中心医院肺病研究所，山东 青岛 266042）

抗结核药物所致药物性肝损伤是最常见和最严重的不良反应[1]，吡嗪酰胺是最常见的诱发肝损伤的一线抗结核药物[2]。由于“肝肠轴”的存在，肝损伤可以改变肠道微生物组成，破坏肠上皮细胞的完整性[3]。益生菌是一类对宿主有益的活的微生物，具有维持肠道内环境稳态、抑制有害菌的生长、调节肠道微生物组成等作用。自1907年Metchnikoff提出乳杆菌属于有益菌之后，越来越多的研究表明，乳杆菌可以通过改善肠道微生物组成、抑制有害菌生长及维持肠道内环境稳定而发挥有益作用[4-6]。目前，已有研究发现补充益生菌在抑制酒精性肝损伤、肝癌等方面具有明显的效果[7-8]，但关于益生菌补充对抗结核药药物性肝损伤及肠道菌群紊乱影响的研究鲜有报道。本研究根据干酪乳杆菌（Lactobacillus casei，LcS）在人群中表现出明显改善作用的剂量，设置了低剂量和高剂量LcS组对服用吡嗪酰胺的大鼠进行干预，把益生菌补充与吡嗪酰胺药物性肝损伤和肠道菌群紊乱结合起来，通过检测大鼠肝脏组织学变化、血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平及肠道菌群代表菌株的改变，初步探讨益生菌改善吡嗪酰胺药物性肝损伤及肠道菌群紊乱的效果，为将来更深入的益生菌与抗结核药药物性肝损伤及肠黏膜屏障损伤的相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性SD大鼠40 只，体质量为180～220 g，购于山东鲁抗医药股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）20130001。

活菌型乳酸菌乳饮品，菌株为活性LcS（活菌浓度为108CFU/mL），由天津养乐多乳品有限公司提供。

吡嗪酰胺片（产品批号1507041） 沈阳红旗制药有限公司；ALT、AST试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒、逆转录实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

BX60型光学显微镜 日本Olympus公司；Adventurer通用型分析天平 美国Ohaus公司；高速冷冻离心机、Realplex4型qPCR仪 德国Eppendorf公司；RM2135型石蜡切片机 德国Leica公司；120全自动生化分析仪 日本TOSHIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 实验模型建立及分组

将40 只SPF级雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为4 组，每组10 只。正常对照组（NC组）给予生理盐水4 mL/（kg·d）灌胃，1 h后给予生理盐水10 mL/（kg·d）灌胃；吡嗪酰胺组（L0组）给予吡嗪酰胺溶液200.0 mg/（kg·d）灌胃[9-10]，1 h后给予生理盐水10 mL/（kg·d）灌胃；低剂量LcS组（L1组）给予吡嗪酰胺溶液200.0 mg/（kg·d）灌胃，1 h后给予LcS 10 mL/（kg·d）灌胃；高剂量LcS组（L2组）给予吡嗪酰胺溶液200.0 mg/（kg·d）灌胃，1 h后给予LcS 20 mL/（kg·d）灌胃，将开始干预记为第0周，连续干预10 周，实验期间动物自由进食及饮水。每组随机抽取5 只大鼠，分别在干预前、干预第6周末、干预第10周末（末次灌胃），采用代谢笼收集各组大鼠粪便各3～5 粒，超低温冰箱保存备用。末次灌胃后，禁食12 h，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，离心分离血清待测，采集相应器官组织进行实验检测。

1.3.2 肝脏组织形态结构观察

于干预第10周末采集大鼠肝左叶中部组织（0.4 cm×0.4 cm×0.3 cm），体积分数为10%的中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，进行苏木精-伊红染色，中性树胶封片，在光学显微镜下（200 倍）采用盲法观察各组大鼠肝脏组织形态结构，随机观察10 个视野，并按照Knodell等[11]的评估标准进行肝脏组织学评分。

1.3.3 大鼠的肝功能血清学指标检测

血清ALT和AST均采用120型全自动生化分析仪进行检测，方法为速率法，检测时均进行室内质量控制，所有数据采集在控后，再严格按照操作规程进行。

1.3.4 大鼠粪便肠道菌群代表菌株定量分析

取待测粪便样品，采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取大鼠粪便样品中肠道菌群基因组总DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书操作。采用特异性引物对大鼠粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌等优势菌进行分析。乳酸杆菌上游引物序列：5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’，下游引物序列：5’-CACCGCTACACATGGAG-3’；双歧杆菌上游引物序列：5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’，下游引物序列：5’-TAAGCGATGGACTTTCACACC-3’；大肠杆菌上游引物序列：5’-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3’，下游引物序列：5’-ACCAGGGTATCTTAATCCTGTT-3’。

采用qPCR技术对粪便乳酸杆菌、双歧杆菌及大肠杆菌16S rDNA V3可变区进行定量分析并制作标准曲线，将待测粪便样品中提取的基因组总DNA进行以上3 种菌株16S rDNA V3可变区qPCR，25 μL PCR体系包括：1 μL DNA（100 ng）、0.75 μL上游引物（10 μmol/L）、0.75 μL下游引物（10 μmol/L）、12.5 μL SuperReal PreMix Plus（2×）、10 μL ddH2O。反应条件：预变性95 ℃，15 min；变性95 ℃，10 s；最佳退火温度（双歧杆菌61 ℃、乳酸杆菌55 ℃、大肠杆菌51 ℃），20 s；延伸72 ℃，30 s；共50 个循环，反应完毕后将系统软件Mastercycler ep realplex自动分析的Ct值代入标准曲线，从而得出以上3 种菌株在待测粪便样品中的含量。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 肝脏组织病理学变化

图1 干预10 周后各组大鼠肝脏组织苏木精-伊红染色（×200）Fig. 1 Liver tissues stained with HE after 10 weeks of intervention (× 200)

由图1可知，NC组大鼠肝小叶结构清晰，肝索呈放射状排列，肝细胞胞浆均匀，肝细胞无明显水肿及脂肪变性；L0组大鼠肝细胞中度水肿，胞浆疏松化，出现明显的气球样变，肝索结构及窦周隙消失，伴有炎性细胞浸润；不同剂量的LcS组大鼠肝小叶结构均较L0组得到明显改善，肝小叶结构清晰，肝索呈放射状排列，肝细胞胞浆均匀，其中L1组大鼠肝细胞轻度水肿，胞浆疏松化；L2组大鼠接近NC组大鼠。

表1 干预10 周后各组大鼠肝脏组织病理学评分（n＝10）Table1 Pathological scores of rat liver tissues after 10 weeks of intervention (n= 10)

根据观察结果对各组大鼠进行病理学评分，由表1可知，L0组大鼠分数明显高于NC组，经过不同剂量的LcS干预后，评分接近NC组，较L0组显著下降。

2.2 肝功能血清学指标

表2 干预10 周后各组大鼠血清ALT和AST水平Table2 Serum ALT and AST levels of rats after 10 weeks of intervention U/L

由表2可知，L0组大鼠血清中ALT和AST水平明显升高，均达到了NC组的1.3 倍左右（P＜0.05）；补充不同剂量的LcS后，大鼠血清中ALT及AST水平较L0组均明显降低（P＜0.05）。

2.3 粪便肠道菌群分析结果

2.3.1 样品熔解曲线

图2 样品各菌株qPCR熔解曲线图Fig. 2 qPCR melting curve for three strains

由图2可知，各qPCR完毕后可见熔解曲线均为单峰，说明扩增产物单一，产物均为目的DNA片段，结果真实性较好。

2.3.2 定量分析结果

2.3.2.1 双歧杆菌

表3 干预前后各组大鼠粪便内双歧杆菌定量分析结果Table3 Quantitative analysis of Bifidobacteria in feces of rats before and after intervention拷贝/g湿粪

由表3可知，在实验干预前大鼠各组间及组内差异均无统计学意义；大鼠经过不同分组及干预时间的延长，其组间及组内均具有统计学差异（F＝2 567.562，P＜0.05；F＝5.490，P＜0.05）。从分组来看，在干预第6周末，L0组大鼠较NC组双歧杆菌的数量明显降低；L1组和L2组大鼠双歧杆菌的数量较L0组均明显升高，分别达到了L0组的1.24 倍和1.44 倍（P＜0.05）；在干预第10周末，L2组大鼠与L0组相比，双歧杆菌的数量明显升高，达到了L0组的1.46 倍（P＜0.05）；从干预时间上，与干预第0周相比，L2组在干预第10周末双歧杆菌的数量明显升高。

2.3.2.2 乳酸杆菌

表4 干预前后各组大鼠粪便内乳酸杆菌定量分析结果Table4 Quantitative analysis of Lactobacillus in feces of rats before and after intervention拷贝/g湿粪

由表4可知，在实验干预前大鼠各组间及组内差异均无统计学意义；大鼠经过不同分组及干预时间的延长，其组间及组内均具有统计学差异（F＝3 568.368，P＜0.05；F＝6.515，P＜0.05）。从分组来看，在干预第6周末，L0组大鼠较NC组乳酸杆菌的数量明显降低，降低了10.8%（P＜0.05）；L2组大鼠乳酸杆菌的数量较L0组与L1组均明显升高，分别达到了1.17 倍和1.14 倍（P＜0.05）；在干预第10周末，L2组大鼠与L0组相比，乳酸杆菌的数量明显升高，达到了L0组的1.08 倍（P＜0.05）。从干预时间上，L0组及L1组大鼠在干预第6周末，乳酸杆菌的量较干预前均显著降低；L0组及L1组大鼠在干预第10周末，乳酸杆菌的量较第6周末明显升高，接近干预前水平；L2组大鼠在干预第10周末，乳酸杆菌的量较干预前明显升高。

2.3.2.3 大肠杆菌

表5 干预前后各组大鼠粪便内大肠杆菌定量分析结果Table5 Quantitative analysis of Escherichia coli in feces of rats before and after intervention拷贝/g湿粪

由表5可知，在实验干预前大鼠各组间及组内差异均无统计学意义；大鼠经过不同分组及干预时间的延长，其组间具有统计学差异（F＝3 534.307，P＜0.05）。从分组来看，在干预第6周末，L0组大鼠较NC组大肠杆菌的数量明显升高（P＜0.05）；L1组和L2组大鼠大肠杆菌的数量较L0组均明显降低（P＜0.05）；在干预第10周末，L0组大鼠较NC组大肠杆菌的数量明显升高（P＜0.05）。从干预时间上，L0组大鼠在干预第6周末，大肠杆菌的量较第0周显著升高；在干预第10周末，大肠杆菌的量较第6周末明显降低，接近干预前水平。

3 讨 论

结核病作为一个全球重要的公共卫生问题，其治疗方案为标准短程化疗，主要采用利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇4种药联合治疗6～8 个月[1]。研究表明约有2%～28%的患者在抗结核治疗过程中出现药物性肝损伤[12]。吡嗪酰胺作为抗结核治疗过程中重要的一线药物，其肝毒性比其他一线药物强[13]。因此，寻找能够减缓结核药物性肝损伤的物质是非常必要的。益生菌可以通过调节肠道菌群，改善肠道微生物的生态环境及提高机体的免疫功能而发挥作用[5-6]，本研究通过益生菌干预服用吡嗪酰胺的大鼠，初步研究益生菌对大鼠肝功能指标及肠道菌群紊乱的改善作用。

ALT和AST是反映肝细胞膜稳定性最敏感的指标[14]，ALT主要分布在肝细胞浆内，AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞的线粒体中，这两种转氨酶在肝细胞内的浓度是血清中的1 000～3 000 倍。在肝损伤的情况下，肝细胞膜通透性增加，转氨酶被释放到血液中[14]，其在血清中的含量与肝细胞受损程度呈正比。肝脏组织病理学观察是评价肝脏损伤程度的金标准，在各类动物肝损伤模型中广泛应用。本研究结果发现较NC组相比，L0组ALT和AST均显著升高了1.3 倍，肝细胞中度水肿，胞浆疏松化，出现明显的气球样变，肝索结构及窦周隙消失，并伴有炎性细胞浸润，病理学评分达到3.20 分，这一结果表明，吡嗪酰胺致大鼠肝损伤模型建立成功，提示吡嗪酰胺会引起大鼠肝细胞水肿及炎性细胞浸润，肝细胞膜通透性增加，使肝细胞膜及肝细胞线粒体损伤；补充不同剂量的LcS后，大鼠血清中ALT及AST水平较L0组均明显降低，肝小叶结构清晰，肝索呈放射状排列，肝细胞胞浆均匀，病理学评分均接近NC组，与Wang Yuhua等[15]研究结果相似，提示益生菌能够通过保护肝小叶结构、肝细胞膜及线粒体膜，起到保护肝脏的作用。

Marshall[16]1998年第一次提出了“肝肠轴”，肝脏和肠道具有非常密切的关系，两者具有相同的胚胎起源，肝脏70%的血液供应来源于肠道，肠道是防御病原菌的第一道防线。正常肠道菌群具有阻断病原微生物定植的作用[17]，而肠道菌群失调会引发一系列的疾病[18]。越来越多的研究表明肠道菌群在肝脏疾病的发病中起重要作用[19-20]，肠道菌群紊乱会引起肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等促炎性细胞因子及内毒素含量升高，肠道通透性增加，促炎性细胞因子及内毒素透过肠道黏膜进入血液，通过门静脉作用于肝脏，引起肝脏损伤[15,21-22]。因此，肠道菌群的稳定对预防肝损伤具有重大意义。

人体肠道是一个复杂且庞大的微生物生态系统，定居着数以万亿的微生物，已确定的基因数达到990万[17,23]。人体肠道菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门等构成[24]。本研究选取3 种肠道菌群代表菌株作为研究对象：大肠杆菌（变形菌门、革兰氏阴性菌）、乳酸杆菌（厚壁菌门、革兰氏阳性菌）、双歧杆菌（放线菌门、革兰氏阳性菌），采用16S rDNA荧光实时定量技术，对大鼠粪便检测大肠杆菌、乳酸杆菌与双歧杆菌的定量变化。结果显示，大鼠经过不同的分组及干预时间的延长，3 种代表菌株在不同组间及同组内不同时间上差异均具有统计学意义。在干预第6周末，L0组双歧杆菌和乳酸杆菌的数量相对于NC组及干预前均明显降低，大肠杆菌的数量均明显升高（P＜0.05），提示L0组出现肠道菌群失调的情况。可能与抗结核药的长期使用，使菌群发生改变有关[25]；到干预第10周末，大肠杆菌数量虽较NC组明显升高，但组内比较结果显示，3 种菌株与干预前差异均无意义，提示肠道菌群失调情况好转，但仍处于失调状态，由于抗菌药不同的处理方案，肠道菌群失调恢复的时间有所不同[26]，在本研究中随着干预时间的延长，机体具有自我修复能力，使肠道菌群失调得以缓慢恢复。研究表明，补充益生菌可以增加肠道内有益菌的含量，减少有害菌的含量，调节肠道菌群[6,22]，发挥肠道菌群阻断有害微生物定植的作用[17]。本研究结果显示：在干预第6周末，益生菌补充组相对于L0组双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显升高，大肠杆菌的数量明显降低，且L2组与L1组相比，乳酸杆菌的数量明显升高（P＜0.05）。在干预第10周末，L2组双歧杆菌和乳酸杆菌的数量相对于L0组及干预前均明显升高（P＜0.05）。这与Schneider等[27]研究结果一致，当补充LcS后，肠道内益生菌数量显著增加。一方面乳杆菌本身作为肠道的有益菌，可平衡肠道菌群种类和数量的改变[28]；另一方面乳杆菌可以在肠道中释放一些对有害菌起作用的抗菌素，也可以释放有益于双歧杆菌等有益菌生长的物质，增加肠道内益生菌的数量，增强有益菌的生命力[29]。另外，益生菌必须达到充足的水平才能在肠道中发挥有益作用[30]，由于肠道细胞的正常生理代谢或药物的作用，会使肠道益生菌从肠道排到粪便，因此长期每天连续摄取益生菌才能保证益生菌发挥有益作用[30]。在干预第6周末，L1组乳酸杆菌数量明显低于干预前，而L2组乳酸杆菌数量高于干预前，且明显高于L1组；到干预第10周末时，L1组乳酸杆菌的数量较第6周末又明显升高，接近干预前水平，而L2组乳酸杆菌数量明显高于干预前，且高于L1组，说明在干预第6周末L1组中LcS在肠道中未达到充足水平且干预时间不够长，不足以调节由吡嗪酰胺引起的乳酸杆菌数量的减少，而随着长期每天连续补充益生菌，肠道中乳酸杆菌的数量逐渐升高，这与王然等[6]的研究结果一致，LcS发挥了益生作用，进而调节由吡嗪酰胺引起的乳酸杆菌数量的减少。以上结果提示益生菌能够抑制大肠杆菌等有害菌的繁殖，促进乳酸杆菌及双歧杆菌等有益菌的生长，调节肠道菌群的平衡状态，且随着干预时间延长及补充剂量的增加，效果更明显。

综上所述，长期服用吡嗪酰胺会造成大鼠肝脏损伤及肠道菌群紊乱；益生菌通过调节肠道菌群，对吡嗪酰胺造成的大鼠肝损伤及肠道菌群紊乱具有保护作用，且延长干预时间及增加补充剂量使保护作用更明显。本研究初步探讨了益生菌对吡嗪酰胺药物性肝损伤及肠道菌群的影响，为将来更深入地研究益生菌与结核药药物性肝损伤的关系提供理论支持，为减缓或降低结核病患者药物性肝损伤和胃肠道不良反应提供新的改善措施和科学依据。益生菌作为一种活性微生物制剂，值得在抗结核治疗中进一步研究和开发。