3D 打印钛金属支架 v-PMMA-Ti 机械及抗菌性能的体外研究

黄辰宇 周进 姚庆强 王黎明

随着金属内植物广泛应用于骨折、关节及脊柱手术中，内植物感染成为临床最具挑战性的并发症[1-3]。内植物的相关感染会导致骨坏死、骨质丢失、血管栓塞及关节破坏，患者需承担巨大的经济开销且难以治愈[4]。

骨科内植物相关感染的治疗通常包括清创术、去除受侵犯组织和静脉使用抗生素治疗[5]，也可以治疗急性骨感染[6]。全身给药需长期使用高剂量抗生素，但由于多数抗生素半衰期短，局部药物浓度较低，所以抗感染常会失败[7]。感染区域的血液循环遭到破坏，只有一小部分抗生素能达到治疗部位[8]。高剂量抗生素全身给药会引起严重的毒副作用[9]。

不适当的抗感染治疗或长期慢性感染会导致局部抗生素耐药性和细菌生物膜形成[10]。另外，治疗时间较长伴有较高的生理学毒性和不可逆的副作用，患者一般难以接受。然而，慢性内植物相关感染需彻底清除坏死和感染的组织，随后接受长期高剂量抗生素治疗。尽管手术技术和抗生素药物不断发展，临床上彻底治愈慢性骨髓炎仍十分困难[11]。

目前常使用局部含抗生素间隔物辅以静脉抗感染进行治疗。既可以弥补局部药物浓度的不足，也可以减小全身的毒性作用，降低耐药性[12-13]。抗生素负载的聚甲基丙烯酸甲酯 ( polymethyl methacrylate，PMMA) 骨水泥常用于治疗植入相关感染。既往研究表明，万古霉素是治疗骨感染的重要广谱糖肽类抗生素，抵抗革兰氏阳性菌活性强[14-15]，同时，体外研究表明万古霉素对成骨细胞和骨骼细胞的负面影响比其它常用抗生素副作用小[16-17]。在临床上，万古霉素可添加到骨水泥中，通过浓度梯度缓慢释放抗生素。可以将万古霉素负载的骨水泥( v-PMMA) 手工制成特殊形状，作为间隔块植入骨感染区域。这些间隔物应与患者的骨缺损形状匹配。然而，在有限的时间内骨水泥难以获得理想的形状，并且生物力学性能难以使下肢长期承受体重。因此，患者通常长期卧床，直到感染被控制继而植入新的假体。此外，抗生素骨水泥的药物释放是否能维持足够长的时间尚不明确[18]。

通过 3D 打印技术构造具有特定形状、结构和复合材料的支架[19-20]。理论上，3D 打印技术可以制造具有个性化形状的支架以匹配骨缺损，同时改进其结构 ( 孔隙形状、孔径、纤维尺寸等) 和材料可增加支架的生物力学性能[21]。研究表明，3D 打印 Ti植入物具有可靠的生物力学性能，如人造椎间盘、髋关节假体、骨肿瘤假体。本研究将 v-PMMA 填充到 3D 打印 Ti 支架的孔中，使 v-PMMA-Ti 支架持续释放抗生素并测试其抗菌活性[22]。然而，v-PMMA是否可以填充到 3DP Ti 支架的孔中，是否具有合理的抗生素效应和可靠的生物力学性能尚不明确。

为此，本研究采用 SLM 3D 打印技术，打印v-PMMA-Ti 复合支架，通过将 v-PMMA 填充到 3DP Ti 支架的孔中制成多孔 Ti 支架。评估复合支架的细胞毒性、抗生素效应、宏观和微观结构及生物力学性能，并将其与 v-PMMA 支架和 3DP Ti 支架进行比较，以证明 v-PMMA-Ti 支架作为抗生素间隔块的可能性。

材料与方法

一、试验材料

1. 试剂：CL41 Ti ELI 粉末 ( Grade 23) ( Concept Laser，德国)、低糖 - DMEM 培养基 ( GIBCO，美国)、胎牛血清 ( GIBCO，美国)、活力 / 细胞毒性试剂盒 ( Molecular Probes，Eugene，美国)、胰蛋白酶( Sigma，美国)、磷酸盐缓冲液 ( 南京凯基生物科技发展有限公司，中国)、骨形成诱导培养基 ( Gibco，美国)、96 孔板 ( Corning，美国)、万古霉素 ( Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories，Kobe，日本)、骨水泥 ( Tecres S.P.A，Verona，意大利)、金黄色葡萄球菌菌株 ( American Type Culture Collection[ ATCC ]25923，南京医科大学附属南京医院检验科，南京)。

2. 仪器：超净工作台 ( 苏州净化设备有限公司，中国)；倒置显微镜 ( Olympus，日本)；MCO-20AIC 型 CO2培养箱 ( SANYO，日本)；MDFU3286S 型深低温冰箱 ( SANYO，日本)；微量移液器 ( Eppendorf，德国)；共聚焦激光扫描显微镜( Eclipse E600W，Nikon，日本)；佳能 550D 单反数码相机；SLM 系统 ( M2 金属 3D 激光打印机，Concept Laser，德国)；高频红外线碳硫分析仪( HW2000B，中国)；氮气氧气测定器 ( ON-836，LECO，美国)；Instron 4502 单轴测试系统 ( Instron Ltd.，High Wycombe，英国)；电感耦合等离子体原子发射光谱仪 ( ICP-AES) ( Huasen，中国)；紫外分光光度计 ( GE Healthcare，瑞典)；场发射扫描电镜 ( Hitachi S4800，Tokyo，Japan)；微孔板高灵敏度分光光度计 ( Tecani-control，Hombrechtikon，瑞士)；酶标仪 ( MODEL 680，Bio-Rad Laboratories Inc.Hercules，CA，USA)。

二、试验方法

1. 3D 打印钛金属支架的制备：使用 Geomagic studio 11.0 软件设计所需圆柱形多孔正交钛金属支架。设计参数：直径 7.2 mm，高 4 mm，纤维直径100 μm，孔隙连通率 100%，多孔结构中纤维以 0 /90° 沉积形成正交支架。按照设计方案，3DP Ti 支架在 SLM 3DP 系统中进行打印。打印支架使用的材料末为直径 ( 25±14) μm ( 5～46 μm) 的 Ti-6Al-4V ELI ( 23 级) 颗粒粉末。在温度 600 ℃～650 ℃、压力 2e-3mBar、高纯度氦气为调节气体的条件下，在起始平台上沉积差不多 50 μm 的钛合金粉末。电子束枪 ( 加速电压 80 kV) 基于设计方案文件逐层熔化粉末制备支架。所有 SLM 打印机的设置保持不变。每个支架用高压吹打和 PBS 缓冲液冲洗 3 次。

首先，使用 5% 质量分数的万古霉素和骨水泥混合物制备 v-PMMA。当 v-PMMA 仍处于粥状期时，将 Ti 支架浸入 v-PMMA 中，并放入真空吸入式压力注射器中。使用 10 MPa 的连续压力使 v-PMMA在 Ti 支架的孔中持续 10 min。然后，将 v-PMMA-Ti支架取出，去除表面多余骨水泥，支架表面进行清洗。在对照组中，v-PMMA 支架由上述骨水泥 ( 含万古霉素) 用模具制成同样大小。

本研究中支架分为三种，分别为钛金属支架记为 Ti，抗生素骨水泥支架记为 v-PMMA。载有抗生素骨水泥的钛金属支架记为 v-PMMA-Ti。

2. 钛金属支架化学成分测定：遵循制造商的方案使用电感耦合等离子体－原子发射光谱仪 ( ICPAES) 测量支架的金属组成成分。将支架样品用强酸溶液溶解，通过喷雾器将获得的样品溶液转化成气溶胶，使用 ICP-AES 扫描仪使用光谱仪检测每个样品在 7000～10 000 K 温度范围内原子发射。碳元素检测使用高频红外线碳硫分析仪，氮、氢、氧元素使用氮氧测定仪检测。

3. 宏观和微观结构形态观察：通过扫描电子显微镜进行支架微结构形态观察。首先观察三种支架的大体形态，用扫描电镜观察其微观结构。体外与细菌共培养后 4 周观察支架的宏观结构形态，记录细菌抑制区的大小和形状。用 2.5% 戊二醛和 4%多聚甲醛将样品固定在 0.1 M 二氯甲磺酸盐缓冲液中，再固定在 1% 四氧化锇中，随后样品在室温下干燥过夜，表面喷金，并通过 SEM 扫描仪观察。

4. 体外药物释放试验：支架使用磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱液为 5 ml，洗脱液在 230 nm 和280 nm 波长处使用微孔板高灵敏度分光光度计检测抗生素的释放量。万古霉素在 280 nm 波长处的最低精度为 2.5 μg / ml，由于检测的标准曲线取值最低为2.5 μg / ml。支架和洗脱液存放在 37 ℃ 的恒温震荡箱后 1、3、5、7、14、21 和 28 天，取出支架，更换新鲜洗脱液，残留洗脱液离心后取 1 ml 进行抗生素浓度测定。洗脱液每个样品取三份一同检测。

5. 抗菌性能的检测：作为引起植入物相关感染的常见病原体之一，利用琼脂扩散法测定细菌抑菌圈直径的检测中最常用的是金黄色葡萄球菌。在本研究中使用的金黄色葡萄球菌菌株 ( American Type Culture Collection [ ATCC ]25923) 浓度约为 1.5×108个菌落形成单位 ( CFU) / ml，并将总共 0.5 ml 的细菌悬浮液均匀地接种在每个 M-H 琼脂平板上，将灭菌的几种不同种类支架放在 Mueller-Hinton 板上后1、3、6、9、12、15、21、24、27 和 30 天测量每个支架抑菌圈直径，这与体外万古霉素释放研究基本一致，将平板 37 ℃ 下孵育后 24 h，测量每个支架周围的抑制区直径。

6. 细胞毒性的检测：从 1 月龄的兔颅骨中分离提取兔成骨细胞。将成骨细胞在含有 10% 胎牛血清、100 单位 / ml 青霉素和 100 μg / ml 链霉素的DMEM 培养基，并在 37 ℃ 的 5% CO2培养箱中培养。每 3 天更换一次培养基，直至细胞贴壁扩增，用胰蛋白酶－EDTA 溶液分离细胞。然后将细胞以1×104个细胞 / 孔的密度接种在 24 孔板上。MTT 法检测细胞活力和增殖情况。在共培养后 1、3、5 和7 天，离心除去培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，并在 200 μl ( 0.5 mg / ml) MTT 和 200 μl PBS 混合溶液中孵育 4 h。去除上清液，结晶物使用 600 μl 二甲基亚砜 ( DMSO) 溶解，并将其移入 96 孔板中。通过酶标仪在波长 490 nm 处测定吸光度，并与 DMSO 标准值进行比较。

7. 机械特性：使用 Instron 4502 单轴测试系统进行支架机械性能测试。将支架固定在平台上，每个测试支架被以 0.1 mm / min 的速度压缩直到达到 10%形变 ( 0.4 mm 位移)，压缩力将被加载到 50% 形变( 2 mm 位移)，记录每组 5 个支架的平均抗压强度，计算±s。

三、统计学处理

使用 SPSS 18.0 软件进行处理，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。统计图表使用 GraphPad Prism 软件完成。

结 果

一、支架的结构特征

C 和 O 元素是抗生素骨水泥最主要的组成部分，它们也是 v-PMMA-Ti 支架表面的重要组成部分。支架的平均直径、高度、纤维直径和多孔支架孔隙率与设计的参数相比，差异无统计学意义 (P＝0.15) ( 表1)。

几种支架的直径均为 7.2 mm、高度均为 4 mm( 图1a～c)。v-PMMA 支架表面较为光滑，v-PMMATi 支架表面较为粗糙 ( 图1d～f)。在 Ti 支架表面发现 C、O 元素沉积，这可能是支架在制作过程中氧化产生的 ( 图2a、c)。v-PMMA 支架表面主要为 C、O 元素，还有少量的 P、Na 和 Ca，支架成分与万古霉素、PMMA 的元素组成一致 ( 图2b、d)。

在 v-PMMA-Ti 支架组，Ti 支架纤维、孔隙微结构与设计值匹配，支架纤维表面有熔化烧结的 Ti 粉颗粒 ( 图3a～b)。v-PMMA 支架表面虽然存在少量突出颗粒，但表面相对光滑，也未看到明显的可以通入支架内部的孔隙及沟壑 ( 图3c～d)。v-PMMA-Ti 支架的微结构，其表面与 v-PMMA 支架相比，粗糙度明显提高，并且可以看到金属纤维小梁及内部填充的 v-PMMA，有较多孔隙及沟壑可以通向支架内部深处 ( 图3e～f)。

图1 支架的设计、构建及成分分析 a～c：Ti 支架的三维 CAD 设计图；d～f：Ti 支架、v-PMMA 支架、v-PMMA-Ti 支架大体结构图Fig.1 Design, construction and analysis of the scaffolds a - c: 3D CAD design of the Ti scaffolds; d - f: General structure of Ti, v-PMMA,v-PMMA-Ti scaffolds

表1 三维 CAD 软件设计的结构数据Tab.1 Designed structure data of CAD

二、万古霉素释放检测

万古霉素释放实验表明，v-PMMA 和 v-PMMATi 支架具有相似的药物释放动力学，在最初的 5 天存在药物突释，在接下来的 23 天内持续稳定释放抗生素。两种支架的抗生素释放速度在前 5 天均明显高于其后的 1、2、3、4 周，且 v-PMMA-Ti 支架释放量百分比明显高于 v-PMMA 支架 [ ( 29.7±3.2) %，( 10.8±4.1) %，P＝0.03 ]，检测后 4 周的 v-PMMATi 支架释放百分比亦明显高于 v-PMMA 支架[ ( 33.4±3.7) %，( 14.4±3.4) %，P＝0.02 ]( 图4a)。

从释放抗生素的总量来看，抗生素释放质量的变化趋势和释放百分比一致，v-PMMA-Ti 支架的释放总质量明显高于 v-PMMA 支架 [ ( 2.26±0.19) mg，( 0.76±0.21) mg，P＝0.02 ]，经过 5 天的抗生素突释后，抗生素释放速度减慢，到 4 周时的 v-PMMATi 支架释放量亦明显大于 v-PMMA 支架 [ ( 2.54±0.31) mg，( 1.01±0.26) mg，P＝0.03 ]( 图4b)。

v-PMMA 和 v-PMMA-Ti 支架的抗生素累计释放总质量 (V)。通过对 1 天、3 天、5 天、1 周、2 周、3 周、4 周的V值测定，两种支架的V值变化趋势与R值接近，其中 v-PMMA-Ti 支架的V值明显高于v-PMMA 支架 [ ( 2.26±0.19) mg，( 0.76±0.21) mg，P＝0.02 ]，经过 5 天的抗生素快速释放后，抗生素释放速度减慢，到 4 周时的 v-PMMA-Ti 支架R值亦明显大于 v-PMMA 支架 [ ( 2.54±0.31) mg，( 1.01±0.26) mg，P＝0.03 ]。

三、抗菌性能的检测

图2 Ti 支架及v-PMMA 支架的化学成分分析Fig.2 Chemical analysis results of the Ti and v-PMMA scaffolds

图3 支架的微观结构 a～b：Ti 支架微结构；c～d：v-PMMA 支架微结构；e～f：v-PMMA-Ti 支架微结构Fig.3 The microstucture of the scaffolds a - b: Microstucture of the Ti scaffolds; c - d: Microstucture of the v-PMMA scaffolds; e - f:Microstucture of the v-PMMA-Ti scaffolds

图4 支架内药物释放检测 a：v-PMMA 和 v-PMMA-Ti 支架的抗生素释放比例 ( R：截止检测时间点的累计释放量 / 载有抗生素总量 × 100%)；b：v-PMMA 和 v-PMMA-Ti 支架的抗生素累计释放总质量 ( V)Fig.4 Drug release level within the scaffolds a: The drug release percentage of the v-PMMA and v-PMMA-Ti; b: Cumulative vancomycin release content of the v-PMMA and v-PMMA-Ti

在 M-H 琼脂平板上放置后 1 天的抑菌圈大体照片，可以看到 Ti 支架周围无明显抑菌圈形成，v-PMMA-Ti 支架抑菌圈 ( 23.0±2.0) mm 大于 v-PMMA 支架 ( 19.0±1.7) mm，两组差异有统计学意义 (P＝0.02) ( 图5a)。用 PBS 缓冲液对v-PMMA-Ti 支架和 v-PMMA 支架进行洗脱后 1 个月，放入 M-H 琼脂平板，1 天后 v-PMMA 组形成的抑菌圈 ( 15.1±0.56) mm 与 v-PMMA-Ti 组 ( 15.2±0.42) mm 接近，两组相比差异无统计学意义 (P＝0.23) ( 图5b)。随着洗脱次数的增加，金黄色葡萄球菌共培养 1 天后，v-PMMA 组和 v-PMMA-Ti 支组所形成的抑菌圈直径也相应变小 ( 图6a)，共培养后1～12 天的 v-PMMA-Ti 组抑菌圈大于 v-PMMA 组，而 18 天、24 天、30 天的两组抑菌圈直径相比，差异无统计学意义 (P＝0.15) ( 图6b)；支架在 PBS 中洗脱 30 天，再放入 M-H 琼脂平板进行抑菌实验，使用扫描电子显微镜观察 v-PMMA 和 v-PMMA-Ti 支架的表面形态，可以看到 v-PMMA 支架表面有细菌集落形成 ( 图7a)，而 v-PMMA-Ti 支架表面未发现细菌集落 ( 图7b)。

图5 支架抗菌性能测试 a～b：支架在含有金葡菌 ( ATCC 25923) 的 MH 平板上所形成的抑菌圈大体照片Fig.5 The anti-bacterial ability of the scaffold a - b: Photos of the inhibitory rings on the MH plate with staphylococcus aureus( ATCC25923)

四、MTT 检测支架对成骨细胞毒性

在体外培养后 1 天、3 天、5 天、7 天，随着培养时间的增加，三组支架的吸光度均随之增加，表明三种支架均没有明显的细胞毒性，细胞可以在支架表面扩增。

同时，在各时间点，三种支架之间的吸光度比较差异无统计学意义 (P＝0.25)，三种支架对细胞增殖的影响差异无统计学意义 (P＝0.31) ( 图8)。

图8 细胞活力 MTT 检测Fig.8 Cell activity MTT test

图6 支架抗菌性能测试 a～b：v-PMMA、v-PMMA-Ti 支架洗脱后不同天数所形成的抑菌圈大小Fig.6 The anti-bacterial ability of the scaffold a - b: Inhibitory rings of the v-PMMA, v-PMMATi scaffolds after the washing with PBS

图7 支架抗菌性能测试 a～b：支架洗脱后 30 天，v-PMMA 和v-PMMA-Ti 支架的表面形态Fig.7 The anti-bacterial ability of the scaffold a - b: Surface situation of the the v-PMMA,v-PMMA-Ti scaffolds after washing with PBS for 30 days

五、支架的力学特征

Ti 支架、v-PMMA 支架、v-PMMA-Ti 支架的轴向压应力测试照片，三种支架均在夹具中固定( 图9a～c)，并接受最大压缩位移 0.8 mm ( 即支架高度的 20%)、加载速度 0.1 mm / min 的轴向应力；三种支架在 5%、10%、15%、20% 形变下的压力结果提示 Ti 支架虽然杨氏模量最大，但是其屈服强度较低，而 v-PMMA 支架的杨氏模量明显小于 Ti 支架和v-PMMA-Ti 支架，v-PMMA-Ti 支架力学特性较 Ti支架和 v-PMMA 支架明显改善，同时具备良好的杨氏模量和屈服强度 ( 图10a～b)。

图9 a～c：Ti 支架、v-PMMA 支架、v-PMMA-Ti 支架的轴向压应力测试照片Fig.9 a - c: Pressure test photos of the Ti, v-PMMA, v-PMMA-Ti scaffolds

图10 三种支架的形变压力 a：三种支架从 0～0.8 mm 形变的应力 - 应变曲线及杨氏模量；b：三种支架在 5%、10%、15%、20% 形变下的压力Fig.10 Stress of the 3 scaffolds a: Stress-strain curve and Young’s modulus of the 3 scaffolds; b: Pressure on the scaffolds of 5%,10%, 15% and 20% deformation

讨 论

尽管使用多种方法，包括手术和抗生素方法治疗内植物相关感染，但是它目前仍然是骨科临床上一个重大的挑战。目前治疗此类感染的金标准是彻底清创和抗生素间隔局部抗生素治疗，其次才是一期清创术[23-25]。

为了提高抗生素骨水泥的抗菌效果，以往研究尝试使用不同种抗生素及不同的抗生素与骨水泥混合方式。抗生素骨水泥药物释放动力学是可调控的，并且受到以下因素影响：抗生素的物化性质、抗生素与骨水泥的混合方法、混合额外添加的辅料[26-27]。在以往研究中，骨水泥抗感染常用的抗生素包括妥布霉素，庆大霉素和万古霉素。其中万古霉素可控制广谱细菌。同时可承受骨水泥混合内部温度升高。然而，由于骨水泥结构较为致密，只有不到 10% 的抗生素可以从骨水泥的紧密结构中释放[28-29]。既往研究表明，妥布霉素作为释放过程中可能产生气泡的抗生素药物，通过气泡来改善万古霉素的释放[30]。但仍有＜10% 的万古霉素可以从 v-PMMA 构建体中释放[31-32]。目前已经有许多填充和混合技术，通过手工制备的珠粒和间隔物增加 PMMA 孔隙率和释放效率[22,33-34]。还有一些可降解和可再吸收的材料已被临床用于局部抗生素的载体。McKee 等[35]对 30 例进行前瞻性随机临床试验，比较局部使用载有妥布霉素的硫酸钙颗粒和手工制作的骨水泥串珠治疗慢性骨髓炎或者感染的疗效，结果显示载有妥布霉素的硫酸钙颗粒效果优于没有抗生素的实验组。有研究表明使用硫酸钙颗粒的患者不论其是否含有抗生素约有 5% 的人会出现切口血肿或渗出[36]。也有将生物可降解材料和骨水泥串珠进行临床疗效比较，发现两者具有相近的感染清除率[37-38]。到目前为止，这些可降解材料相对于骨水泥的惟一临床优势是减少二次手术的需要。然而，更为细致的研究发现聚合物制成的支架可能在体内降解过程中产生酸性物质[39]。这些研究中钙盐颗粒或聚合物材料的临床研究并未说明其对于骨水泥的优势。

在本研究中，与 v-PMMA 支架相比，v-PMMATi 支架展现出更强的药物释放能力和良好的稳定性。与此同时，v-PMMA-Ti 支架通过抑菌圈的测量也显示出更可靠的抗菌作用。在细胞毒性检测方面，v-PMMA-Ti 支架的药物释放和本身材料与v-PMMA 支架以及 Ti 支架相比并不会影响成骨细胞的增殖。通过 SEM 扫描观察，v-PMMA-Ti 支架的粗糙表面能够提高药物的释放效率。同时，骨水泥和钛纤维之间的空隙可使支架所载药物释放更完全。

既往研究基于感染的内植物或者假体 / 局部骨形状来制备抗生素间隔。然而手工制作不能完美匹配所需的形状。在术中由于骨水泥固化要在较短时间内制作出满意的形状比较困难。随着快速原型( RP) 技术的发展，人们利用 3D 打印技术构建具有人性化形状、结构和复合材料的支架。利用 SLM 3D打印技术可以制作具有特殊形状的多孔 Ti 支架。同时，这种支架可以装载抗生素骨水泥进而起到良好的抗菌作用。

抗生素骨水泥的特性使得它不能在较长时间内承受肢体的重量。作为常用的医用内植物材料，与v-PMMA 材料相比钛金属合金已经被证明具有足够的生物力学能力。在此研究中，与 v-PMMA 和 3DP Ti 材料相比，v-PMMA-Ti 支架显示出更好的生物力学性能。

综上所述，作为药物载体，v-PMMA-Ti 支架比v-PMMA 支架有更好的抗菌效果。此外，其机械性能也相对稳定，v-PMMA-Ti 支架有望成为高效、可靠和简便的抗骨感染材料。进一步的体内研究可以为这种生物材料用于骨感染控制提供更多的证据。