运动预适应通过间歇性缺血缺氧诱导细胞自噬参与早期心肌保护的研究

孙其龙，潘珊珊，黄 悦，王家银，陆 矫



运动预适应通过间歇性缺血缺氧诱导细胞自噬参与早期心肌保护的研究

孙其龙，潘珊珊，黄 悦，王家银，陆 矫

上海体育学院 运动科学学院, 上海 200438

目的：通过分析运动性心肌缺血缺氧与细胞自噬的关系，检测自噬相关蛋白Beclin1/Bcl-2在早期运动预适应（EEP）及保护期的变化，探讨细胞自噬在EEP心肌保护效应中的作用。方法：SD大鼠随机分为对照组（C组）、早期运动预适应组（EEP组）、力竭运动组（EE组）和早期运动预适应+力竭运动组（EEP+EE组）。1）用化学发光免疫分析法（CLIA）检测血浆cTnI含量，结合HE和HBFP相邻切片染色，综合评价心肌缺血缺氧的程度，验证EEP心肌保护效应。2）用免疫印迹和免疫荧光双标法检测并观察Beclin1/Bcl-2的表达变化和解离程度。3）通过相关性分析评估运动性缺血缺氧与细胞自噬的关系。结果：1）与C组相比，EEP组血浆cTnI水平和MOD值均具有升高的趋势（＞0.05），且EE组和EEP+EE组升高具有显著性（＜0.05）；与EE组相比，EEP+EE组cTnI水平和MOD值显著降低（＜0.05）；与C组相比，其余各组心肌组织均显示不同程度的缺血缺氧改变，HE染色嗜酸性增强部位与HBFP染色艳红色阳性区域趋近一致。2）与C组相比，其余各组Beclin1均显著升高（＜0.05），Beclin1/Bcl-2解离程度增加（＜0.05），而Bcl-2并无明显变化；与EE组相比，EEP+EE组Beclin1/Bcl-2共定位程度显著升高（＜0.05）。3）各组IHA和IOD值均与Beclin1/Bcl-2共定位程度呈显著负相关（＜0.05）。结论：EP通过间歇性缺血缺氧可以诱导心肌细胞自噬，细胞自噬参与了EP对运动性心肌损伤的早期保护效应。

运动预适应；缺血缺氧；Beclin1；Bcl-2；细胞自噬；早期心肌保护

反复短时间的大强度间歇有氧运动导致心肌间歇性相对间或绝对缺血缺氧，提高心肌耐受缺血缺氧的能力，减轻随后长时间缺血缺氧所致的心肌损伤，这种通过运动诱导机体产生内源性心肌保护效应的方式称为运动预适应（exercise preconditioning，EP）[3,18,20,22]。研究发现，EP的保护效应与缺血预适应（ischemic preconditioning，IP）类似，具有抗缺血/再灌注（ischemic/reperfusion，I/R）损伤的心肌保护效应，如减轻I/R损伤后心肌梗塞面积，降低恶性心率失常的发生率，预防心肌顿抑等[8,22]。本研究团队曾发现，EP具有抵抗异丙肾上腺素导致的急性心肌损伤[25]，减轻力竭运动导致的运动性心肌损伤[11,24]。EP可以分为诱导期和保护期，通过反复短时间的大强度间歇有氧运动诱导早期和晚期两个保护时相。早期EP（early exercise preconditioning，EEP）保护期在EP结束后即可产生，持续1～3 h，晚期EP（late exercise preconditioning，LEP）保护期在EP结束后12 h出现，24~48 h达到高峰，持续24~72 h[3,14]。

自噬是真核细胞内特有的生命现象，可选择性的将细胞内衰老、损伤的细胞器或蛋白质，在溶酶体内降解再利用的生理过程[2,9]。正常生理条件下，自噬通常维持在相对较低的水平，当细胞受到能量缺乏、氧化应激、缺血缺氧等因素刺激时，自噬被激活，从而参与并维持细胞的存活以及内环境的稳定[9,15]。自噬的发生受多种信号通路的调控，有着复杂的分子机制，其中，Beclin1作为多种信号通路的汇集点，通过与Bcl-2相互作用发挥至关重要的调控作用[12]。在应激因素刺激下，Beclin1/Bcl-2所保持的复合体形式解离，游离的Beclin1继而发挥诱导自噬的功能[5]。研究发现，自噬的发生与Beclin1表达上调和Bcl-2表达下调相关联，而Beclin1/Bcl-2比值也在一定程度上能够反映自噬与凋亡的程度[19]。Peng等[23]为探讨细胞自噬在缺血性心脏中的作用，发现IP能够增强Beclin1/Bcl-2相互作用，诱导心肌细胞自噬减轻I/R损伤，参与了缺血性心脏的早期保护作用。马晓雯等[1]在探讨长期耐力训练对自噬相关因子Beclin1的影响时发现，大强度运动训练可以增强大鼠心肌细胞自噬的活性，同时伴有Beclin1水平的明显升高。万栋峰等[3]研究了心肌线粒体自噬在EP晚期保护效应中的作用，发现抑制细胞自噬后EP对运动性心肌损伤的晚期保护作用减弱，提示细胞自噬部分参与了EP的晚期心肌保护效应。基于上述研究背景，本研究假设EP通过间歇性缺血缺氧能够诱导心肌细胞自噬，而细胞自噬可能参与了EP对运动性心肌损伤的早期保护效应。本研究在EP动物模型的基础上，采用相邻切片HE和HBFP染色评价心肌缺血缺氧程度；通过相关性分析评估心肌缺血缺氧与细胞自噬的关系；采用血浆心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）检测与HBFP染色验证EP早期心肌保护效应；结合免疫印迹和免疫荧光双标实验，检测并观察自噬相关蛋白Beclin1/Bcl-2的表达变化和解离程度，探讨细胞自噬在EP早期保护效应中的作用，为EP心肌保护效应及机制的研究提供新的实验依据。

1 研究材料与方法

1.1 动物分组和运动实验方案

图1 运动实验方案示意图

Figure 1．Exercise Experimental Protocol

1.2 动物取材

采用10%水合氯醛（40 mg/100 g体重）对大鼠进行腹腔麻醉，将麻醉后的大鼠呈仰卧位固定于解剖台上，打开腹腔，下腔静脉取血5 mL，用于cTnI含量检测。每组随机取10只大鼠进行灌注固定，打开胸腔，暴露心脏，于心尖处插入灌注针头，先注入1%肝素2 mL，再快速灌注0.85%生理盐水约250 mL，并迅速剪断下腔静脉。待流出液基本无血色后，换滴4%多聚甲醛约250 mL，整个灌注过程大约持续30 min。灌注结束后取出心脏，入4%多聚甲醛后固定24 h。常规石蜡包埋，制作相邻切片，用于HE染色、HBFP染色和免疫荧光双标实验。每组其余10只大鼠麻醉取血后，打开胸腔，取出心脏，-80℃保存，用于免疫印迹实验。

1.3 血浆cTnI 含量检测

用化学发光免疫分析法（chemiluminescent immunoas-say, CLIA）检测大鼠血浆cTnI含量。CLIA是一种双抗体一步夹心免疫酶检测方法，采用碱性磷酸酶标记的单克隆cTnI IgG抗体试剂与样本短暂孵育后，加入顺磁性微粒作为固相载体与样本中cTnI结合，再加入化学发光底物（Lumi-Phos*530），用光度计测量发光量，发光量与cTnI的浓度成正比，采用Beckman Coulter公司的Access 2免疫分析系统进行测定，线性范围为0.02～100 ng/mL。

1.4 心肌组织相邻切片HE和HBFP染色

用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色观察心肌细胞的形态结构，其嗜酸性增强用于显示缺血缺氧的心肌组织。用苏木素-碱性复红-苦味酸（hematoxylin basic fuchsin picric staining，HBFP）染色特异性显示心肌组织的缺血缺氧变化，正常心肌组织被染成棕黄色，而缺血缺氧的心肌组织则被染成艳红色。用HE和HBFP染色的相邻切片综合评价心肌组织缺血缺氧的程度。使用Leica（RM2235）切片机进行连续切片，用心肌组织相邻切片分别进行常规HE染色和HBFP染色。HBFP染色切片常规脱蜡至水，苏木素染液浸染5 min，1%盐酸酒精分化3 s，用0.1%碱性复红液浸染3 min，去离子水冲洗后丙酮漂洗30 s，0.1%苦味酸纯丙酮浸染40 s，脱水透明后，中性树胶封片。

1.5 心肌组织HBFP染色图像采集与处理

每组随机选取5张HBFP染色切片，每张切片随机选取5个视野，每组共测25个视野，使用Olympus（BX60）显微镜进行形态学观察，DP70数码摄影装置采集图像，使用Image-ProPlus 6.0图像分析软件进行图像处理。在同一放大倍数下（×400），测定缺血缺氧面积（ischemia-hypoxia area，IHA）与积分光密度（integral optical density，IOD），并计算平均光密度（mean optical density，MOD），以表示单位面积内缺血缺氧损伤的程度（MOD=IOD/ IHA）。

1.6 心肌组织Beclin1/Bcl-2免疫印迹实验

用免疫印迹实验检测心肌组织Beclin1/Bcl-2的表达变化。大鼠心肌组织提取总蛋白，BCA法检测并调整蛋白浓度。加入上样缓冲液，100℃恒温加热10 min使蛋白变性。SDS凝胶电泳并转膜后，5%脱脂奶粉封闭2 h。分别孵育一抗（小鼠抗大鼠Beclin1，美国Santa Cruz公司，sc-11427，1:1 000；兔抗大鼠Bcl-2，美国Santa Cruz公司，sc-492，1:1 000），4℃过夜。加HRP标记的二抗，室温孵育1 h。滴加发光液后，采用Fusion FX全自动化学发光成像图像获取系统进行曝光显影，采用Image J分析软件测定Beclin1、Bcl-2及内参GAPDH的条带灰度值。

1.7 心肌组织Beclin1/Bcl-2免疫荧光双标实验

用免疫荧光双标实验观察Beclin1/Bcl-2荧光强度及共定位程度。石蜡切片常规脱蜡至水，微波热修复20 min。山羊血清封闭20 min后，加入Beclin1/Bcl-2混合一抗（小鼠抗大鼠Beclin1，美国Santa Cruz公司，sc-11427，1:200；兔抗大鼠Bcl-2，美国Santa Cruz公司，sc-492，1:200），4℃孵育过夜。滴加Alexa Fluor 647（红）、Alexa Fluor 488（绿）标记的混合二抗(Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG，美国abcam公司，ab150111，1:400；Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG，美国abcam公司，ab150081，1:400），37℃温箱孵育60 min。DAPI染核，5 min后流水冲洗终止反应，PVP防荧光淬灭剂封片。采用Zeiss LSM700激光共聚焦显微镜观察并采集图像。每组随机选取5张切片，每张切片随机选取5个视野，每组共测25个视野，在同一放大倍数下（×400），用Zen 2012（black version）计算机图像分析软件分析荧光强度和共定位程度。荧光强度反映Beclin1/Bcl-2蛋白的表达变化情况，共定位程度反映Beclin1/Bcl-2复合体的解离情况。

1.8 心肌组织缺血缺氧与Beclin1/Bcl-2共定位程度的相关性

采用HBFP染色中IHA和IOD值，分别与免疫荧光双标实验中Beclin1/Bcl-2共定位程度进行相关性分析，评估心肌组织缺血缺氧与细胞自噬的关系。每组随机选取5张HBFP染色切片，每张切片随机选取5个视野，每组共测25个视野，使用Olympus（BX60）显微镜进行形态学观察，DP70数码摄影装置采集图像，使用Image-ProPlus 6.0图像分析软件进行图像处理，测定IHA和IOD值。每组选取5张免疫荧光双标相邻切片，每张切片选取相对应的5个视野，每组共测25个视野，使用Zeiss LSM700激光共聚焦显微镜观察并采集图像，采用Zen 2012（black version）计算机图像分析软件测定Beclin1/Bcl-2共定位程度。每组IHA和IOD值与Beclin1/Bcl-2共定位测定值相对应，进行相关性分析。

1.9 数据统计与分析

实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行处理，实验结果以均数±标准差（M±SD）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验进行组间比较，相关性分析用CORRELATE中Bivariate检验，以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 血浆cTnI含量检测结果

大鼠血浆cTnI含量检测结果显示（表1），与C组相比，EEP组大鼠血浆cTnI水平有升高的趋势（＞0.05），且EE组和EEP+EE组升高具有显著性（＜0.05）；与EE组相比，EEP+EE组血浆cTnI水平显著降低（＜0.05）。

表 1 大鼠血浆cTnI水平变化

注：*表示与C组相比＜0.05；#表示与EE组相比＜0.05，下同。

2.2 心肌组织相邻切片HE和HBFP染色结果

大鼠心肌组织相邻切片HE和HBFP染色结果显示（图2），HE染色中C组心肌细胞轮廓界限清晰，细胞核呈卵圆形，被染为淡蓝色，细胞质着色均匀，被染为淡红色，未见嗜酸性增强区域（图2-A）；EEP组心肌细胞形态结构与C组相似，偶有心肌细胞出现嗜酸性增强的现象（图2-B）；EE组大量心肌细胞出现嗜酸性增强的现象（图2-C）；EEP+EE组少部分心肌细胞出现了嗜酸性变化，较EE组明显减少（图2-D）。HBFP染色中正常心肌组织被染为棕黄色，缺血缺氧心肌组织被染为艳红色；C组心肌细胞轮廓清晰，细胞核被染为淡紫蓝色，未见艳红色阳性区域（图2-E）；EEP组偶有心肌细胞出现斑点状的艳红色阳性区域（图2-F）；EE组中大量心肌细胞出现艳红色阳性区域（图2-G）；EEP+EE组部分心肌细胞出现了团块状艳红色阳性改变，较EE组明显降低（图2-H）。在HE染色和HBFP染色的相邻切片上，从缺血缺氧损伤区域的位置比照中发现，各组HE染色嗜酸性增强部位与HBFP染色艳红色阳性区域趋近一致（图2）。

图2 大鼠心肌组织相邻切片HE和HBFP染色结果图（×400）

Figure 2. Results of HE and HBFP Staining of Adjacent Slices in Rats Myocardium（×400）

2.3 心肌组织HBFP染色图像分析结果

心肌组织HBFP染色图像分析结果显示（表2），心肌组织IHA和IOD值变化趋势相似，用MOD值表示各组大鼠心肌组织中单位面积内缺血缺氧的程度。与C组相比，EEP组MOD值具有升高的趋势（＞0.05），且EE组和EEP+EE组升高具有显著性（＜0.05）；与EE组相比，EEP+EE组MOD值明显降低，差异具有显著性（＜0.05）。

2.4 心肌组织Beclin1/Bcl-2免疫印迹检测结果

大鼠心肌组织Beclin1免疫印迹检测结果显示（图3），与C组相比，其余各组Beclin1蛋白水平均明显升高，差异具有显著性（＜0.05）；Bcl-2免疫印迹检测结果显示（图4），各组Bcl-2蛋白水平无显著性变化；Beclin1/Bcl-2比值结果显示（图5），与C组相比，EEP组Beclin1/Bcl-2比值具有升高的趋势（＞0.05），且EE组、EEP+EE组升高具有显著性（＜0.05）。

表2 大鼠心肌组织HBFP染色结果图像分析

注：*与C组相比＜0.05；#与EE组相比＜0.05。

图3 大鼠心肌组织Beclin1水平变化图

Figure3. Change of Beclin1 Level in Rats Myocardium

图4 大鼠心肌组织Bcl-2水平变化图

Figure4. Change of Bcl-2 Level in Rats Myocardium

图5 大鼠心肌组织Beclin1/Bcl-2水平变化图

Figure5. Change of Beclin1/Bcl-2 Level in Rats Myocardium

2.5 心肌组织Beclin1/Bcl-2免疫荧光双标结果

大鼠心肌组织Beclin1/Bcl-2免疫荧光双标检测结果显示（图6），Beclin1被标记为红色荧光，Bcl-2被标记为绿色荧光，二者的共定位重叠区域为黄色，均散在分布于胞质中，细胞核被DAPI标记为蓝色。与C组（图6-A）相比，EEP组（图6-B）、EE组（图6-C）、EEP+EE组（图6-D）Beclin1红色荧光强度均有不同程度的增加，而黄色共定位区域则均有不同程度的降低，提示，EEP组、EE组和EEP+EE组Beclin1蛋白表达升高，Beclin1/Bcl-2复合体解离程度加强；与EE组（图6-C）相比，EEP+EE组（图6-D）红色荧光强度减弱，而黄色共定位区域增多，提示，EEP+EE组Beclin1蛋白表达降低，Beclin1/Bcl-2复合体解离程度降低。

图6 大鼠心肌组织Beclin1和Bcl-2免疫荧光双标实验结果图（×400）

Figure 6. Double Immunotluorescence Results of Beclin1 and Bcl-2 in Rats Myocardium（×400）

Beclin1荧光强度结果显示（图7），与C组相比，其余各组Beclin1荧光强度均显著升高（＜0.05）。Bcl-2荧光强度结果显示（图8），各组Bcl-2荧光强度无显著性差异。Beclin1/Bcl-2共定位程度结果显示（图9），与C组相比，其余各组Beclin1/Bcl-2共定位程度均明显降低，差异具有显著性（＜0.05）；与EE组相比，EEP+EE组Beclin1/Bcl-2共定位程度则显著升高（＜0.05）。

图7 大鼠心肌组织Beclin1荧光强度柱状图

Figure 7. Intensity of Beclin1 in Rats Myocardium

图8 大鼠心肌组织Bcl-2荧光强度柱状图

Figure 8. Intensity of Bcl-2 in Rats Myocardium

图9 大鼠心肌组织Beclin1/Bcl-2共定位程度柱状图

Figure 9. Colocalization of Beclin1/Bcl-2 in Rats Myocardium

2.6 心肌组织缺血缺氧与Beclin1/Bcl-2共定位程度相关性

大鼠心肌组织HBFP染色IHA和IOD值与免疫荧光双标Beclin1/Bcl-2共定位程度的相关分析结果显示（图10），EEP组（图10-a）大鼠心肌组织IHA值与Beclin1/Bcl-2共定位程度高度负相关（=-0.783，＜0.05），IOD值与Beclin1/Bcl-2共定位程度高度负相关（=-0.772，＜0.05）；EE组（图10-b）大鼠心肌组织IHA值与Beclin1/Bcl-2共定位程度高度负相关（=-0.905，＜0.05），IOD值与Beclin1/Bcl-2共定位程度高度负相关（=-0.912，＜0.05）；EEP+EE组（图10-c）大鼠心肌组织IHA值与Beclin1/Bcl-2共定位程度高度负相关（=-0.861，＜0.05），IOD值与Beclin1/Bcl-2共定位程度之间高度负相关（=-0.853，＜0.05）。以上结果显示，EEP组（图10-a）、EE组（图10-b）、EEP+EE组（图10-c）IHA和IOD值与Beclin1/Bcl-2共定位程度之间，均存在高度负相关关系，提示，随着缺血缺氧损伤程度的升高，Beclin1/Bcl-2复合体解离，更多游离的Beclin1参与了自噬发生的诱导作用，心肌细胞自噬水平也因此升高。

3 讨论

3.1 运动预适应通过间歇性缺血缺氧诱导心肌细胞自噬

运动作为一种强烈的刺激因素，极大地提高了心肌耗氧量，导致心肌相对间或绝对缺血缺氧[11]。HE染色便于对心肌组织结构全面观察，以往也常用心肌细胞的嗜酸性增强间接显示心肌组织的缺血缺氧，但其不具备特异性。HBFP染色是显示心肌组织早期缺血缺氧的形态学方法，显示心肌组织的缺血缺氧具有特异性，因此，长期以来本研究团队采用HBFP染色方法，用于评价心肌组织的缺血缺氧改变。本次实验采用HE染色和HBFP染色的相邻切片，综合评价心肌组织缺血缺氧的改变程度。结果显示，与C组相比，其余各组HE染色中，心肌组织均出现了不同程度嗜酸性增强的现象；HBFP染色中心肌组织同样出现了不同程度的艳红色阳性区域，EEP组MOD值具有升高的趋势，且EE组和EEP+EE组升高具有显著性；在相邻切片的基础上，通过心肌组织缺血缺氧区域的位置比照，本研究发现，各组HE染色中嗜酸性增强部位与HBFP染色中艳红色阳性区域趋近一致。这提示，不论是EEP及EEP保护期，还是一次大强度力竭运动，均导致大鼠心肌组织发生不同程度的缺血缺氧改变。

Beclin1是介导哺乳动物自噬的基因，对于自噬的发生有着重要的促进作用。Bcl-2是一种抗凋亡基因，可通过与Beclin1相互作用影响自噬过程[12]。在正常生理条件下，Bcl-2与Beclin1以蛋白复合体形式存在，由此抑制了Beclin1诱导自噬的功能[5]。但当细胞受到应激因素刺激时，Beclin1/Bcl-2复合体解离，游离的Beclin1继而与PI3KC3结合形成新的复合体，从而诱导细胞自噬的发生[4]。研究发现，自噬的发生与Beclin1表达上调和Bcl-2表达下调相关联，而Beclin1/Bcl-2比值也在一定程度上能够反映凋亡与自噬的程度[19]。Huang等[13]在探讨细胞自噬与IP心脏保护效应的关系时，发现IP能够激活心肌细胞自噬，并能有效减小I/R后心肌梗死面积。Yuan等[26]在EP心肌保护效应的研究中发现，EP可以减轻一次大强度力竭运动所致的心肌缺血缺氧损伤，同时伴有自噬相关蛋白的明显变化。为进一步探讨心肌缺血缺氧与细胞自噬的关系，本研究特别采用免疫荧光双标实验检测Beclin1/Bcl-2共定位程度，并分别与HBFP染色中的IHA和IOD值进行相关性分析。结果显示，EEP组、EE组和EEP+EE组中，IHA和IOD值均与Beclin1/Bcl-2共定位程度呈显著负相关关系，提示，随着心肌缺血缺氧程度的升高，Beclin1/Bcl-2复合体解离，更多游离的Beclin1参与了自噬发生的诱导作用，心肌细胞自噬水平也因此升高。此结果进一步提示，不论是EEP及EEP保护期，还是一次大强度力竭运动，均可通过缺血缺氧诱导心肌细胞自噬。

图10 大鼠心肌组织缺血缺氧与Beclin1/Bcl-2共定位程度相关分析图

Figure 10. The Correlation between the Ischemia-hypoxia and the Colocalization of Beclin1/Bcl-2 in Rat Myocardium

3.2 细胞自噬参与运动预适应早期心肌保护效应

EP早期保护效应已被较多研究所证实。Parra等[22]在EP结束10 min后对狗进行的I/R中发现，心肌梗死面积相比对照组减少了76%，提示，EP诱导的早期保护效应可以减轻I/R损伤。Shen等[24]探讨EP心肌保护作用时，在EP结束后30 min对大鼠进行了一次大强度力竭运动，发现EP可以明显减轻力竭运动所致的心肌损伤，对运动性心肌损伤产生了早期保护作用。cTnI是心肌细胞特有的结构蛋白，对心肌损伤具有较高的特异性、敏感性以及较长的窗口期，现已成为诊断心肌损伤的“金标准”。Eijsvogels等[7]在运动强度与cTnI释放量关系的研究中发现，运动员血液中cTnI含量与运动强度之间存在显著正相关关系。本研究在EP结束30 min后，对大鼠进行一次大强度力竭运动，采用血浆cTnI检测与HBFP染色相结合的方法，从血液和形态学方面综合评价心肌损伤与保护程度。结果显示，与EE组相比，EEP+EE组血浆cTnI水平和MOD值均显著降低，进一步证实EP可以提高心肌耐受缺血缺氧的能力，减轻心肌在一次大强度力竭运动中的缺血缺氧损伤，对运动性心肌损伤具有早期保护作用。

细胞自噬可能是EP参与心肌保护的机制之一。Gurusamy等[10]在自噬相关蛋白BAG-1与IP心脏保护效应的研究中发现，IP诱导了Beclin1表达升高的细胞自噬，参与了I/R所致心肌损伤的保护作用。Mcginnis等[21]在探讨EP对心肌I/R损伤的保护作用时，对小鼠进行速度为18 m/min的跑台运动，发现EP同样减轻了心肌I/R损伤，同时增强了自噬相关蛋白的活性，但并未发现Beclin1发生显著性变化。本研究对大鼠进行速度为30 m/min的大强度跑台运动，采用免疫印迹与免疫荧光双标实验相结合的方法，综合评价Beclin1/Bcl-2的表达变化和解离程度。结果显示，与C组相比，其余各组Beclin1蛋白水平均显著升高，Beclin1/Bcl-2共定位程度显著降低，同时，Beclin1/Bcl-2比值有升高趋势，且EE组和EEP+EE组升高具有显著性，提示，不论是EEP及EEP保护期，还是一次大强度力竭运动，均可促使Beclin1蛋白表达的升高，促进Beclin1/Bcl-2复合体解离，并有效上调心肌细胞自噬水平。本研究免疫荧光双标实验结果显示，与EE组相比，EEP+EE组Beclin1/Bcl-2共定位程度显著升高，提示，在EP早期心肌保护效应中，Beclin1表达升高的细胞自噬部分参与了EP对运动性心肌损伤的保护作用。

自噬在心血管应激中是把“双刃剑”，适度自噬有助于细胞保护和生存，但自噬过度或自噬缺陷将导致细胞损伤或死亡。有研究表明，在一定条件下自噬可以转化为自噬性细胞凋亡[17]。Liu等[16]探讨了细胞自噬在不同强度运动中的作用，发现随着运动强度的增加，细胞自噬和凋亡程度均明显升高，超负荷运动会使大鼠心肌细胞自噬体数量增加，凋亡细胞增多，同时伴有Beclin1表达升高和Bcl-2/Bax比值的下降。Meyer等人[6]认为，在应激刺激的初始阶段，自噬可通过维持细胞内能量稳态参与细胞的保护作用，但随着刺激强度的增加，自噬角色可能会在细胞保护和损伤之间发生切换。本研究结果提示，不论是EEP及EEP保护期，还是一次大强度力竭运动，均可通过缺血缺氧诱导心肌细胞自噬，但EEP本身并未导致明显的心肌损伤，且EEP诱导的细胞自噬参与了EP对力竭所致的心肌损伤的早期保护作用。一次大强度力竭运动导致明显的心肌损伤，其诱导的心肌细胞自噬是进一步减轻心肌损伤，还是使心肌损伤程度进一步加重，尚待深入探讨。

4 结论

EP通过间歇性心肌缺血缺氧可以上调自噬相关蛋白Beclin1的表达，促进Beclin1/Bcl-2复合体解离，诱导心肌细胞自噬。细胞自噬参与了EP对力竭运动所致的心肌缺血缺氧损伤的早期保护作用。

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Exercise Preconditioning Induces Cellular Autophagy by Intermittent Ischemia-Hypoxia to Participate in Early Myocardial Protection

SUN Qi-long，PAN Shan-shan，HUANG Yue，WANG Jia-yin，LU Jiao

Shanghai University of Sport, Shanghai 200438, China.

Objective: By analyzing the relationships between myocardial ischemia-hypoxia and cellular autophagy in exercise, and by detecting changes of autophagy-associated proteins Beclin1/Bcl-2 in early exercise preconditioning (EEP) and in early protective phase, the effects of cellular autophagy on EEP-cardioprotection were discussed. Methods: SD rats were randomly divided into the groups of control (C group), early exercise preconditioning (EEP group), exhaustive exercise (EE group), and early exercise preconditioning+exhaustive exercise (EEP+EE group). 1）The plasma cTnI contents were detected by chemiluminescence immunoassay (CLIA) method, which were combined with the adjacent slices between HE-staining and HBFP-staining, to comprehensively assess the extents of myocardial ischemia-hypoxia, and to verify the EEP-cardioprotection. 2) The expressional changes and the dissociated degrees in Beclin1/Bcl-2 were detected by immune-blotting, and were observed by double-labeling immunofluorescence, respectively. 3) The relationships between exercise-induced hypoxia-ischemia and cellular autophagy were assessed by the correlational analysis. Results: 1) Compared with the C group, the plasma cTnI levels and the MOD values in the EEP group to both have increasing tendencies (>0.05), and these in the EE group and in the EEP+EE group to were both significant increase (＜0.05). Compared with the EE group, the plasma cTnI levels and the MOD values in the EEP group to were both significant decrease (＜0.05). Compared with the C group, all other groups to represent ischemia-hypoxia changes in different degree, which were as the acidophily-enhanced positions in HE-staining approaching to the positive areas of crimson in HBFP-staining. 2) Compared with the C group, all other groups to have significantly increased Beclin1 levels (＜0.05), and to have increased extents of Beclin1/Bcl-2 dissociations (＜0.05), but which were without any changes in Bcl-2 levels. Compared with the EE group, the extents of Beclin1/Bcl-2 co-localization were significant increase (＜0.05). All groups represented with significantly negative correlations between the Beclin1/Bcl-2 co-localization and the ischemia-hypoxia areas, and the IOD values respectively. Conclusion: EP can induces autophagy in cardiomyocytes by intermittent ischemia-hypoxia, in which the cellular autophagy participates in the early myocardial protection against the exercise-induced myocardial injury.

1000-677X(2018)07-0025-08

10.16469/j.css.2018070015

G804.7

A

2018-02-12；

2018-07-08

国家自然科学基金资助项目(31471136)。

孙其龙,男,在读硕士研究生,主要研究方向为运动与心血管健康,E-mail:578926656@qq.com; 潘珊珊,女,教授,博士,博士研究生导师,主要研究方向为运动与心血管健康, E-mail:panshanshan@sus.edu.cn。