药用真菌白刺马勃的生药学研究*

徐维茵，李 昂，胡 德，张智超，王淑敏**

（1.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2.吉林省生物研究所，吉林 长春 130012）

白刺马勃（Lycoperdon wrightii Berk.&Curt.）为马勃科（Lycoperdaceae） 马勃属（Lycoperdon） 大型药用真菌，入药部位为干燥子实体[1]。子实体成熟后内部充满孢丝和孢子粉，孢子粉可药用[2]。白刺马勃味辛、平，入肺经，可用于解毒、消肿，更是止血良药[3]，还可用于治疗风热郁肺咽痛，音哑，咳嗽，外用鼻衄，创伤出血[4]。白刺马勃虽不是《中国药典》（2015版） 正品马勃（脱皮马勃 Langermannia fenzlii、大马勃Calvatia gigantea和紫色马勃Calvatia lilacina）[5]，但民间大部分地区也将其作马勃入药。白刺马勃由于个体较小，常易与小马勃Lycopedon pusillum混淆，因此本文对白刺马勃进行生药学研究，为今后的应用研究和开发利用提供参考。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器

XL 30 FEG型电子显微镜，FEI公司；YYS-100E型生物显微镜，上海圆仪光学仪器有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.2 试验材料

麦角甾醇对照品，中国食品药品检定研究院，批号：MUST11070601，纯度＞98%；麦角甾酮对照品，上海源叶生物科技有限公司，批号：X22M8L32255，纯度＞96%；甲醇，色谱纯，美Fisher公司；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。白刺马勃子实体采集于长春中医药大学校园草坪，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为白刺马勃（Lycoperdon wrightii Berk.＆Curt.）。

2 方法

2.1 白刺马勃的鉴别

2.1.1 基原鉴别

白刺马勃的原基鉴别，结果见图1和图2。

由图1和图2可以看出，白刺马勃子实体较小，高 0.5 cm～2.0 cm，直径 0.5 cm～2.5 cm，生长初期呈白色，外包被有密集的白色小刺，其尖端成丛聚合成角锥形，后期其小刺脱落，露出淡色的内包被。孢子体呈青黄色，不孕基小或无。生长在草丛或林下草地上，往往丛生在一起。

图1 白刺马勃幼嫩子实体Fig.1 Young fruiting body of Lycoperdon wrightii

图2 白刺马勃成熟子实体Fig.2 Mature fruiting body of Lycoperdon wrightii

2.1.2 性状鉴别

白刺马勃的性状鉴别，结果见图3。

图3 白刺马勃药材Fig.3 Herbs of Lycoperdon wrightii

由图3可以看出，白刺马勃子实体小，近圆形或陀螺形，或被压扁，有不规则凹陷，具短柄。头部直径可达2.5 cm，高可达2.0 cm。柄基部具纤维质丛枝状假根。老时表面孢体呈黄褐色，顶部形成开口，内有黄褐色至暗褐色棉絮状丝状物，触之有褐色孢子飞扬。2.1.3 显微鉴别

白刺马勃子实体的显微鉴别结果见图4和图5。

由图4和图5可以看出，光学显微镜下孢子呈球形或卵圆形，浅黄色。电子显微镜下孢子呈卵圆形，直径 3 μm～4.5 μm，表面有细小疣状突起，孢子柄短，孢丝线形，近无色[6]。

图4 白刺马勃孢子光镜下观察（10×40）Fig.4 Observation on the spores of Lycoperdon wrightii(10×40)

图5 白刺马勃孢子电镜下观察（10 000×）Fig.5 Observation on the spores of Lycoperdon wrightii（10 00×）

2.1.4 理化性质鉴别

火试：取子实体置于火焰上，轻轻抖动，即可见微细的火星飞扬，熄灭后，产生白色浓烟。

薄层鉴别：取白刺马勃粉末约1 g，加二氯甲烷40 mL，超声30 min，滤过，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取麦角

图6 麦角甾醇对照品图（282 nm）Fig.6 Chromatogram of ergosterol(282 nm)

图8 麦角甾酮对照品图（349 nm）Fig.8 Chromatogram of ergotsterone(349 nm)

分别精密称取麦角甾醇和麦角甾酮对照品适量，加色谱甲醇制成每l毫升含麦角甾醇0.05 mg的溶液和每l毫升含麦角甾酮10 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称取白刺马勃粉末2.0071 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL二氯甲烷，超声30 min，放至室温，滤过，精密量取续滤液25 mL，减压干燥，残渣加适量色谱甲醇使之溶解，转移至5 mL量瓶中，定容，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。甾醇和麦角甾酮对照品，加入甲醇溶解，分别制成每1毫升含麦角甾醇0.5 mg和麦角甾酮0.02 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（《中国药典》2015版第4部，0502） 试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以石油醚（60℃～90℃） -乙酸乙酯（7:3） 为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.2 白刺马勃麦角甾醇和麦角甾酮的含量测定

2.2.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（ODS-C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水 （96:4），流速 1.0 mL·min-1，柱温 28℃，进样量10 μL，麦角甾醇检测波长为282 nm，麦角甾酮检测波长为349 nm。理论塔板数以麦角甾醇峰计算不得少于10 000，麦角甾酮峰不得少于10 000。记录色谱图与标准谱图一致，见图6～图9。

2.2.2 对照品溶液的制备

图7 白刺马勃样品（282 nm）Fig.7 Chromatogram of ergosterol in Lycoperdon wrightii(282 nm)

图9 白刺马勃样品（349 nm）Fig.9 Chromatogram of ergotsterone in Lycoperdon wrightii(349 nm)

3 结果

3.1 白刺马勃的鉴别

薄层鉴别结果见图10～图12。

白刺马勃供试品色谱中有专属性的蓝色荧光斑点。喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的专属斑点。喷显色剂后再置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，有专属性的蓝色和绿色荧光斑点。

图10 365 nm紫外光灯下检视Fig.10 Viewing under 365 nm UV lamp

图11 显色后日光灯下检视Fig.11 Viewing under fluorescent lamp after color rendering

图12 显色后365 nm紫外光灯下检视Fig.12 Viewing under 365 nm UV lamp after color rendering

3.2 麦角甾醇和麦角甾酮含量测定结果

3.2.1 方法学考察

（1）标准曲线和线性范围的考察

分别取麦角甾醇对照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL，取麦角甾酮对照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，分别注入液相色谱仪，按照“2.2.1”项条件测定。麦角甾醇以质量（μg） 为横坐标（X），麦角甾酮以质量（ng） 为横坐标（X），均以吸收峰面积值为纵坐标（Y），获得线性回归方程分别为Y=1 741 574X-1 438 （r=1）、Y=3 186.2X-2 282.9 （r=1）。结果表明麦角甾醇和麦角甾酮的量分别在 0.1 μg～0.5 μg （r=1）、19.88 μg～139.16 ng（r=1） 范围内呈现良好的线性关系。

（2） 精密度考察

分别取麦角甾醇和麦角甾酮对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按照“2.2.1”项条件测定，各重复6次。测得麦角甾醇的RSD值为0.12%、麦角甾酮的RSD值为0.19%，结果表明仪器精密度良好。

（3） 稳定性考察

取白刺马勃子实体供试品溶液，按照“2.2.1”项条件测定，进样量为10 μL，分别测定其在0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h内的峰面积值。测得白刺马勃子实体中麦角甾醇的RSD值为0.23%、麦角甾酮的RSD值为0.44%，结果表明样品在24 h内稳定。

（4） 重复性考察

取同一批白刺马勃子实体各6份，按照“2.2.3”项条件制备样品，按照“2.2.1”项条件进行测定。测得白刺马勃子实体中麦角甾醇的RSD值为0.23%、麦角甾酮的RSD值为0.44%。结果表明该方法重复性良好。

（5） 加样回收考察

精密称取已测定的白刺马勃子实体共6份，分别加入一定量的麦角甾醇和麦角甾酮对照品溶液，按照“2.2.3”项条件制备样品，按照“2.2.1”项条件进行测定，结果见表1～表2。

从表1、表2可以看出，白刺马勃麦角甾醇的平均回收率为100.28%，RSD值为0.39%。麦角甾酮的平均回收率为99.82%，RSD值为0.42%。待测样品的回收率和相对标准偏差均在限度范围内，表明该方法准确度较高。

3.2.2 样品含量测定

表1 白刺马勃麦角甾醇加样回收率（n=6）Tab.1 Recovery of ergosterol in Lycoperdon wrightii(n=6)

表2 白刺马勃麦角甾酮加样回收率（n=6）Tab.2 Recovery of ergotsterone in Lycoperdon wrightii(n=6)

取白刺马勃子实体，按照“2.2.3”项条件制备样品，按照“2.2.1”项条件测定其中麦角甾醇和麦角甾酮的量，以外标一点法进行计算。测得白刺马勃子实体中麦角甾醇平均含量为0.0808 mg·g-1，麦角甾酮的平均含量为 16.4871 μg·g-1。

4 讨论

本试验通过对白刺马勃的生态考证、子实体的性状鉴别、孢子的光镜和电镜特征观察以及相应的理化性质鉴别等研究，建立了综合鉴别白刺马勃真伪的方法。薄层色谱结果表明，白刺马勃含有麦角甾醇和麦角甾酮成分。经高效液相色谱法测定，麦角甾醇含量为 0.0808 mg·g-1，麦角甾酮含量为16.4871 μg·g-1。麦角甾醇（ergosterol）是真菌类的特征甾醇，主要存在于绝大多数的真菌细胞膜中，据报道麦角甾醇的量与真菌的生物量存在着相关关系，是真菌生物量的重要标志物之一[7]。生物体中的麦角甾醇量稳定，可以麦角甾醇为生物指标对真菌进行鉴别[8]。麦角甾醇为脂溶性维生素D2的前体[9]，具有抗癌、防衰老、减毒等功效[10]。麦角甾酮（ergosterone）专属性强、紫外响应值高，且对其研究较少。因此，建立简单、快速的方法测定马勃药材中麦角甾酮含量是必要的。本试验建立的白刺马勃中麦角甾醇和麦角甾酮含量测定方法，可作为白刺马勃质量控制的重要检测方法，其麦角甾醇和麦角甾酮的含量也为今后白刺马勃质量标准的建立提供借鉴。