饲粮中添加叶酸和维生素B12对雏鹅盲肠菌群结构的影响

程漫漫 张廷荣 王宝维 孔 敏 张名爱 岳 斌 葛文华

(青岛农业大学优质水禽研究所，国家水禽产业技术体系营养与饲料功能研究室，青岛 266109)

肠道微生物与动物营养代谢、肥胖、脂肪沉积和糖尿病等有密切的关系，肠道微生物在营养代谢方面主要作用于碳水化合物代谢、蛋白质和氨基酸代谢、脂质代谢、维生素代谢及矿物质代谢等[1]。研究表明肠道微生物还与宿主功能关系密切，能够维持宿主健康、提高生产性能、降低环境污染以及提高动物产品安全性[2-4]。动物肠道中存在的大量菌群在提高营养物质利用以及维护动物机体健康等方面起了很大的作用。为此，进一步研究肠道菌群结构与营养利用率、生产性能的关系对指导动物饲粮配制具有重要意义。研究表明，叶酸是一种重要的B族维生素，对于维持动物机体健康、正常的生理机能和生产性能具有重要作用，而且是肠道微生物的必需物质，肠道微生物要竞争性的合成和利用一定量的叶酸[5]，而维生素B12作为一碳代谢的辅酶，可以提高叶酸利用率，促进多种DNA合成等[6]。叶酸和维生素B12缺乏除导致白细胞数量减少外，还可使淋巴细胞功能损害，影响体液免疫，造成中性粒细胞杀菌能力下降[7]。高通量测序技术早已被用来研究家禽肠道微生物多样性，研究结果表明在鸡的盲肠中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为主要优势菌门[8-9]。饲粮中添加叶酸、维生素B12对家禽生产性能影响的研究已有报道[10-12]，但有关不同水平叶酸和维生素B12组合对雏鹅肠道微生物的研究还处于空白。本试验在饲粮中添加不同水平的叶酸和维生素B12，在研究饲粮中添加叶酸和维生素B12对雏鹅生长性能影响的基础上，利用16S rRNA高通量测序技术对饲喂添加不同水平叶酸和维生素B12饲粮的雏鹅的盲肠菌群进行分析，比较雏鹅盲肠菌群组成和结构，进一步研究叶酸和维生素B12对雏鹅肠道菌群结构的影响，旨在确定叶酸和维生素B12添加水平与雏鹅盲肠菌群结构的关系，探讨提高家禽生长性能的途径，并为鹅营养需要量标准的制订提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及饲粮组成

叶酸：饲料级，叶酸含量为96%，宁夏金维制药股份有限公司产品。维生素B12：维生素B12含量为1%，宁夏金维制药股份有限公司产品。

基础饲粮以NRC(1994)[13]为主要参考依据配制，其组成及营养水平见表1。采用高效液相色谱法测得基础饲粮中叶酸含量为0.42 mg/kg，维生素B12含量为0.00 mg/kg。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)多维和微量元素(不含叶酸和维生素B12)为每千克饲粮提供The multivitamin and trace elements (without folic acid and VB12) provided the following per kg of the diet：VA 1 500 mg，VD3200 IU，VE 12.5 mg，VK31.5 mg，VB12.2 mg，VB25.0 mg，烟酸 nicotinic acid 65 mg，VB62 mg，生物素 biotin 0.2 mg，泛酸pantothenate 15 mg，胆碱 choline 1 000 mg，Fe 90 mg，Cu 6 mg，Mn 85 mg，Zn 85 mg，I 0.42 mg，Se 0.3 mg，Co 2.5 mg。
2)叶酸和维生素B12为实测值，其他营养水平为计算值。Folic acid and VB12were measured value，while other nutrient levels were calculated values.

1.2 试验设计

试验用鹅由国家水禽产业技术体系育种基地高密银河润雁鹅业有限公司提供。选择初始体重差异不显著(P>0.05)的1日龄五龙鹅360只，随机分为6组，每组6个重复，每个重复10只鹅，公母各占1/2。试验采用2×3(叶酸×维生素B12)两因素交叉等重复的析因设计，饲粮中叶酸的添加水平分别为0.55、2.50 mg/kg，维生素B12的添加水平分别为0.009、0.018、0.036 mg/kg，试验分组见表2。试验期为4周(1～28日龄)。

表2 试验分组Table 2 Experiment grouping mg/kg

1.3 饲养管理

试验前鹅舍进行彻底全面的消毒，以防止疾病的传播；采用全期舍饲，地面饲养；试验鹅自由饮水和采食；少喂勤添；搞好鹅舍内环境卫生，保持地面洁净干燥，观察鹅的健康状况，做好疾病防控工作。

1.4 样品采集与指标测定

1.4.1 生长性能测定

饲养试验结束后停饲6 h，然后逐只空腹称重，统计各组试验鹅的体重和增重情况，计算终末体重(FBW)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)

1.4.2 盲肠菌群结构测定

1.4.2.1 盲肠样品的采集

空腹称重后，各重复随机选择2只鹅，公母各占1/2，颈静脉放血致死后迅速剖开腹腔，无菌操作取出盲肠，迅速收集到冻存管中液氮保存，然后转移到-80 ℃冰箱保存待测。

1.4.2.2 盲肠细菌总DNA的提取

对每个样品进行单独测定，采用天根生化科技有限公司的基因组DNA试剂盒提取出盲肠细菌总DNA。

1.4.2.3 盲肠细菌总DNA的定量和纯度检测

总DNA含量用DNA定量仪进行测定，DNA纯度用OD260/OD280进行表述，同时用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。

1.4.2.4 PCR扩增及细菌16S rRNA测序分析

按照细菌16S rRNA(V3+V4)区域合成引物：上游引物，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物，5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。样品检测时PCR预试验的程序如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共25个循环。

1.5 数据统计与分析

利用SPSS 17.0软件中一般线性模型(GLM)分析主效应和互作，再用ANOVA和LSD法对数据进行差异显著性分析。将优化序列进行聚类，划分操作分类单位(OTU)，基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、属、种分类学水平上的菌群结构图、物种丰度聚类热图等。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加叶酸和维生素B12对雏鹅生长性能的影响

饲粮中添加叶酸和维生素B12水平对雏鹅终末体重、平均日增重和料重比的影响见表3。饲粮中添加不同水平的叶酸对雏鹅终末体重、平均日增重和料重比的影响均不显著(P>0.05)。饲粮中添加不同水平的维生素B12对雏鹅终末体重、平均日增重的影响显著(P<0.05)，对料重比的影响不显著(P>0.05)。叶酸和维生素B12的交互作用对雏鹅终末体重、平均日增重的影响显著(P<0.05)，对料重比的影响不显著(P>0.05)。其中，Ⅳ组的终末体重和平均日增重显著高于其他5组(P<0.05)，表明饲粮中添加2.50 mg/kg叶酸和0.009 mg/kg维生素B12时雏鹅的生长性能最佳。

2.2 饲粮中添加叶酸和维生素B12对雏鹅盲肠菌群结构的影响

2.2.1 菌群α多样性分析结果

由表4可知，饲粮中添加不同水平的叶酸和维生素B12组合使雏鹅盲肠微生物的丰度和多样性发生了改变。Ⅳ组的OUT数、ACE指数、Chao1指数最高，表明Ⅳ组盲肠微生物的物种丰度高于其他5个组；Ⅴ组的Shannon指数最高，Simpson指数最小，表明Ⅴ组的群落多样性最高，个体分配最均匀。另外，本试验还统计了反映OUT测序深度的指数覆盖度(coverage)，6组样本的coverage值均大于0.999，表明样本中物种被测出的概率很高。

表3 饲粮中添加叶酸和维生素B12对雏鹅生长性能的影响Table 3 Effects of folic acid and VB12 supplementations on growth performance of gosling

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。ns=差异不显著。
In the same row, values with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). ns= not significant.

表4 α多样性指数Table 4 α diversity indices

Shannon曲线是利用各样本的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建的曲线，以此来反映各样本在不同测序量时的微生物多样性。由图1可知，起初曲线直线上升，随后缓慢升高直至平滑，6组样本均表现出先骤增后趋于某一个定值的趋势，由此表明，6组样本的测序量都足以覆盖样本中绝大部分微生物。

由图2可知，本试验样本组成的红色箱式曲线先缓慢升高后趋于平缓，表明物种不随样本量的增加而显著增多；绿色箱式曲线先下降后趋于平缓，表明所取样本中的共有物种趋于饱和。红色和绿色箱式曲线结果均说明本试验所取样本量足以反映当前所有微生物物种。

2.2.2 菌群相似性分析结果

通过分析不同组样本OUT的组成可以反映样品的差异和距离。采用非加权组平均(UPGMA)法对样本进行聚类分析。距离标尺下，由样本UPGMA聚类树(图3)可知，Ⅰ组与Ⅵ组距离最小，说明Ⅰ组与Ⅵ组盲肠菌群组成相似性最高；Ⅰ组与Ⅱ组距离最大，说明Ⅰ组与Ⅱ组盲肠菌群组成相似性最低。这说明饲粮中添加不同水平的叶酸和维生素B12对雏鹅盲肠菌群结构产生了一定的影响。图4所示的组间主坐标分析(PCoA)结果与该结果相似。

D1：Ⅰ组；D2：Ⅱ组；D3：Ⅲ组；D4：Ⅳ组；D5：Ⅴ组；D6：Ⅵ组。下图同。
D1: group Ⅰ; D2: group Ⅱ; D3: group Ⅲ; D4: group Ⅳ; D5: group Ⅴ; D6: group Ⅵ. The same as below.
图1Shannon曲线
Fig.1 Shannon curve

图2 属水平物种累积曲线图Fig.2 Cumulative curve chart of species in genus level

图3 UPGMA聚类树Fig.3 UPGMA clustering tree

图4 PCoA图Fig.4 PCoA chart

图5为雏鹅盲肠菌群属水平物种丰度聚类热图。由图可知，Ⅱ组与Ⅳ组颜色差异最大，分支距离也最远，表明Ⅱ组与Ⅳ组在属水平上菌群相似性最低；Ⅰ组与Ⅲ组、Ⅵ组颜色差异均较小，距离较近，表明Ⅰ组与Ⅲ组、Ⅵ组在属水平上菌群相似性均较高；Ⅱ组与Ⅴ组颜色差异最小，距离最近，表明Ⅱ组与Ⅴ组在属水平上菌群相似性最高；Ⅲ组与Ⅳ组颜色差异最小，距离最近，表明Ⅲ组与Ⅳ组在属水平上菌群相似性最高。上述结果说明饲粮中添加不同水平的叶酸和维生素B12使雏鹅盲肠菌群结构发生了变化。

2.2.3 优势菌群分析

图6显示的是饲粮添加不同水平的叶酸和维生素B12对雏鹅盲肠菌群门水平丰度的影响。在相似性97%的门水平下，所有盲肠样本中检测到10个菌门，其中Ⅵ组、Ⅴ组、Ⅳ组均检测出9个菌门，Ⅲ组、Ⅱ组分别检测到8和7个菌门。分别计算盲肠样本中检测到的菌门的相对丰度，可知厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门。图7显示的是优势菌门的相对丰度，Ⅱ组厚壁菌门相对丰度最高，为61.5%，显著高于其他各组(P<0.05)；Ⅵ组拟杆菌门相对丰度最高，为38.4%，与Ⅲ组、Ⅴ组差异不显著(P>0.05)；Ⅰ组变形菌门相对丰度最高，为37.7%，显著高于Ⅱ组、Ⅴ组(P<0.05)。此外，蓝藻菌门(Cyanobacteria)在Ⅳ组的相对丰度最高，为1.89%，疣微菌门(Verrucomicrobia)在Ⅵ组的相对丰度最高，为3.1%，无壁菌门(Tenericutes)在Ⅴ组的相对丰度最高，为2.7%。其他菌门如放线菌门(Actinobacteria)和脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度较低(<0.1%)，甚至在有些样本中未检测到。饲粮添加不同水平的叶酸和维生素B12使雏鹅盲肠菌群门水平丰度发生了变化，其中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门变化明显，这说明，饲粮中添加不同水平叶酸和维生素B12改变了雏鹅盲肠菌群结构。

图8显示了饲粮添加不同水平的叶酸和维生素B12对雏鹅盲肠菌群属水平丰度的影响。所有盲肠样本中共检测到91个菌属，Ⅰ～Ⅵ组分别检测到86、84、83、87、87、83个菌属。如图8所示，相对丰度较高的5个属分别为脱磷弧菌属(Desulfovibrio)、杆菌属(Bacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、另枝菌属(Alistipes)和巴那斯拉菌属(Barnesiella)。如图9所示，相对丰度排名前5的优势菌属的相对丰度在不同组之间存在较大差异。脱磷弧菌属在Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅳ组中相对丰度较高，与另外3组差异显著(P<0.05)；Ⅳ组的杆菌属相对丰度最高，显著高于其他5组(P<0.05)；Ⅴ组的拟杆菌属相对丰度最高，显著高于Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组(P<0.05)；Ⅵ组的另枝菌属相对丰度最高，显著高于除Ⅲ组外的其余各组(P<0.05)；Ⅲ组的巴那斯拉菌属相对丰度最高，显著高于其他5组(P<0.05)。

图5 属水平物种丰度聚类热图Fig.5 Species abundance clustering heat map in genus level

图10显示了饲粮中添加不同水平的叶酸和维生素B12对雏鹅盲肠菌群种水平丰度的影响。如图11所示，在种水平，6组样本中，杆菌(Bacillus)在Ⅰ～Ⅵ组中的相对丰度分别为93.5%、93.7%、87.8%、95.2%、93.4%和87.9%，表明杆菌在雏鹅盲肠种水平上有绝对优势。饲粮中添加不同水平叶酸和维生素B12组合对雏鹅盲肠中其他菌种相对丰度的影响均未达到显著水平(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 叶酸和维生素B12的功能与相互关系

肠道微生物既影响着营养物质的消化、吸收和能量供应，又调控着宿主正常生理功能及疾病的发生与发展，肠道微生态系统对机体正常功能的运行有着至关重要的影响[14]。目前，关于用高通量测序来测定家禽肠道菌群的研究早有报道。研究表明，肠道微生物及其代谢对肉仔鸡的营养、健康与疾病具有重要的影响和调控作用，通过营养方式干预宿主肠道微生物健康已经成为动物营养学研究的热点[10]。研究表明，在玉米-豆粕型肉仔鸡饲粮中添加叶酸，可提高采食量和体重且以3.0 mg/kg叶酸组的效果最显著[11]。薛安永等[12]发现，在8周龄肉杂鸡饲粮中添加叶酸，日采食量和日增重在含有1.64 mg/kg叶酸组与其他各组间存在显著差异；与对照组比较，日增重和日采食量在叶酸添加组有增加的趋势。余有贵[15]研究表明，叶酸具有维持动物免疫系统正常功能的作用，其缺乏会提高动物对细菌的敏感性，阻碍淋巴细胞正常功能的发挥及抗体的合成。

Unknown：未知菌；Others：其他；Actinobacteria：放线菌门；Deferribacteres：脱铁杆菌门；Lentisphaerae：黏胶球形菌门；Tenericutes:无壁菌门；Verrucomicrobia:疣微菌门；Cyanobacteria:蓝藻菌门；Proteobacteria:变形菌门；Bacteroidetes:拟杆菌门；Firmicutes:厚壁菌门。
图6门水平物种分布柱状图
Fig.6 Distribution histogram of species in phylum level

Firmicutes:厚壁菌门；Bacteroidetes:拟杆菌门；Proteobacteria:变形菌门；Cyanobacteria:蓝藻菌门；Verrucomicrobia:疣微菌门。
数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图9和图11同。
Data columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.9 and Fig.11.
图7各组门水平优势菌结构与分布
Fig.7 Structure and distribution of dominant microorganisms in phylum level of each group

Unknown：未知菌；Others：其他；Anaerotruncus:厌氧棍状菌属；Parabacteroides:副类杆菌属；Phascolarctobacterium:考拉杆菌属；Faecalibacterium:柔嫩梭菌属；Ruminococcaceae UCG-014:瘤胃球科菌UCG-014菌属；Barnesiella:巴那斯拉菌属；Alistipes:另枝菌属；Bacteroides:拟杆菌属；Bacterium:杆菌属；Desulfovibrio:脱磷弧菌属。
图8属水平物种分布柱状图
Fig.8 Distribution histogram of species in genus level

Desulfovibrio:脱磷弧菌属；Bacterium:杆菌属；Bacteroides:拟杆菌属；Alistipes:另枝菌属；Barnesiella:巴那斯拉菌属。
图9各组属水平优势菌结构与分布
Fig.9 Structure and distribution of dominant microorganisms in genus level of each group

维生素B12作为辅酶，参与一碳单位的合成，在DNA甲基化中起着非常重要的作用。维生素B12影响着叶酸的代谢效率，并且参与嘌呤和核苷酸的合成，同时维持DNA的合成与修复，保证染色体的稳定性。维生素B12在机体内主要通过2种物质吸收和转运，分别是内源因子(intrisic factor,IF)和钴胺转运蛋白(transcobalamin，TC)。所以，维生素B12实际上与核酸和蛋白质的合成密切相关[16]。维生素B12依赖的是蛋氨酸合成酶，能催化1个甲基基团,从甲基四氢叶酸上转移至同型半胱氨酸(Hcy)，形成蛋氨酸，最终形成S腺苷蛋氨酸(SAM)。缺乏维生素B12将减少DNA甲基化的SAM可利用量，从而影响其基因的表达[17]。叶酸与维生素B12联合应用的研究常见于医学报道，而在家禽营养学上的研究基本处于空白。本试验首次利用高通量测序技术研究饲粮中联合添加不同水平的叶酸和维生素B12对雏鹅盲肠菌群结构的影响，以探讨不同添加水平叶酸和维生素B12的组合效应对盲肠菌群结构的干预效果。本试验中Ⅳ组(叶酸添加水平2.50 mg/kg×维生素B12添加水平0.009 mg/kg)的OUT数、ACE指数、Chao1指数均最高，表明Ⅳ组盲肠微生物的物种丰度高于其他5组，饲粮中添加不同水平的叶酸和维生素B12能够影响雏鹅盲肠菌群组成和数量。

Unknow：未知菌；Alpha_proteobacterium:α-变形菌；Rumen_bacterium：瘤胃细菌；Lachnospiraceae_bacterium：毛螺菌科细菌；Organism：组织有机体；Bacillus：杆菌。图11同 The same as Fig.11。
图10种水平物种分布柱状图
Fig.10 Distribution histogram of species in species level

3.2 饲粮中添加叶酸和维生素B12对雏鹅盲肠菌群结构的影响

研究证明，厚壁菌门与肠道吸收营养息息相关，肥胖人体内厚壁菌门一般维持一个较高的比例，且菌群多样性程度较差，同时厚壁菌门细菌种类的比例增加可能有助于肥胖的病理生理学，肥胖的严重程度往往与厚壁菌门占比呈正相关[18]。厚壁菌门主要功能是对碳水化合物和蛋白质进行水解，而拟杆菌门主要作用于类固醇、多糖和胆汁酸的代谢，有助于宿主对多糖的吸收以及蛋白质的合成[19]。Hildebrandt等[20]在对RELⅡ基因敲除小鼠和野生鼠从正常饮食切换到高脂肪饮食后发现，拟杆菌门的数量有所减少而厚壁菌门和变形菌门的数量有所增加，作者推测这种变化是由高脂肪饮食引起而不是肥胖本身所引起。本试验在所有雏鹅盲肠样本中共检测到10个菌门，其中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为优势菌门，这与之前的报道[21]结果一致。各组盲肠样本在门、属水平上的菌群分布均存在差异。在门水平上，Ⅱ组厚壁菌门的相对丰度最高，Ⅵ组拟杆菌门的相对丰度最高，Ⅰ组变形菌门的相对丰度最高。在属水平上，相对丰度最高的5个属分别为脱磷弧菌属、杆菌属、拟杆菌属、另枝菌属和巴那斯拉菌属，且优势菌属的相对丰度在不同组之间存在较大差异，在种水平上，6组鹅盲肠样本中杆菌均有绝对优势，但组间差异不显著。这表明饲粮中添加不同水平的叶酸和维生素B12影响了雏鹅盲肠的菌群结构。结合生长性能结果，饲粮中添加2.50 mg/kg叶酸和0.009 mg/kg维生素B12的组雏鹅的终末体重和平均日增重最高，进一步表明饲粮中叶酸和维生素B12组合通过调节雏鹅盲肠菌群结构影响其生长性能。

图11 各组种水平优势菌结构与分布Fig.11 Structure and distribution of dominant microorganisms in species level of each group

4 结 论

① 饲粮中添加2.50 mg/kg叶酸和0.009 mg/kg维生素B12的组雏鹅的终末体重和平均日增重最高。

② 饲粮中添加2.50 mg/kg叶酸和0.009 mg/kg维生素B12的盲肠菌群OUT数、ACE指数、Chao1指数最高，物种丰度最高。

③ 盲肠优势菌门和优势菌属的相对丰度在不同组之间存在较大差异，但杆菌在各组雏鹅盲肠中均占有绝对优势。

④ 由此得出，饲粮中添加2.50 mg/kg叶酸和0.009 mg/kg维生素B12能够优化雏鹅盲肠菌群结构，增加有益菌的丰度，进而提高生长性能。